嚴(yán)君君 胡瑤 曾曉寧 周希喬

結(jié)直腸癌組織中Gα蛋白i亞基的表達(dá)及臨床意義

嚴(yán)君君 胡瑤 曾曉寧 周希喬

目的 研究Gα蛋白i亞基(Gαi)在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 50例結(jié)直腸癌腫瘤及對(duì)應(yīng)切緣正常組織標(biāo)本,采用定量即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)法檢測(cè)腫瘤及切緣正常組織中Gαi1、Gαi2、Gαi3 mRNA表達(dá)水平差異;蛋白印跡(Western blot)法以及免疫組化法對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),分析與Gαi1、Gαi2、Gαi3表達(dá)情況相關(guān)的因素,并探討其表達(dá)與病理組織分型及預(yù)后之間的相關(guān)性。 結(jié)果 結(jié)直腸癌組織Gαi1、Gαi2、Gαi3 mRNA 及蛋白的表達(dá)均明顯低于配對(duì)的切緣正常組織(P<0.05)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,與配對(duì)的癌旁正常組織比較,結(jié)直腸癌組織中Gαi1、Gαi2、Gαi3表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。單因素分析顯示,腫瘤T分級(jí)越差(χ2=4.919,P=0.027),TNM分期越高(χ2=7.284,P=0.007),腫瘤分化程度越差(χ2=6.826,P=0.033),伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人(χ2=4.468,P=0.035),其癌組織Gαi2的表達(dá)水平越低。 結(jié)論 結(jié)直腸癌組織中Gαi表達(dá)下調(diào),其中Gαi2的表達(dá)與腫瘤T分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤分化程度呈正相關(guān),而與年齡、性別以及神經(jīng)轉(zhuǎn)移與否無(wú)關(guān)。

結(jié)直腸癌; Gα蛋白i亞基; 表達(dá)

結(jié)直腸癌是全球最常見(jiàn)惡性腫瘤之一,占新發(fā)腫瘤病例的8%,僅次于肺癌及生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。隨著對(duì)其高危因素的不斷認(rèn)識(shí)及結(jié)直腸內(nèi)鏡篩查技術(shù)的逐漸普及,結(jié)直腸癌病人5年生存率稍有升高,但其死亡率仍高達(dá)8.3%。研究表明異三聚體鳥(niǎo)苷酸調(diào)節(jié)蛋白(G蛋白)信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-3]。Gα蛋白i亞基的功能缺失與突變可影響上皮細(xì)胞的代謝與生長(zhǎng)[4-5]。本研究利用定量即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)、免疫組織化學(xué)染色及Western blot 等方法,檢測(cè)腸癌及配對(duì)切緣正常組織中Gα蛋白i亞基的表達(dá),進(jìn)一步分析臨床病理與Gα蛋白i亞基表達(dá)的相關(guān)性及其對(duì)預(yù)后的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集50例南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院于2010年1月至2016年10月期間行結(jié)直腸癌切除術(shù)病人新鮮腫瘤及對(duì)應(yīng)切緣正常組織標(biāo)本,術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何放療和化療,且經(jīng)病理科檢驗(yàn)證實(shí)。新鮮標(biāo)本收集后部分經(jīng)-80 ℃液氮迅速凍存,剩余部分標(biāo)本立即經(jīng)10%福爾馬林固定以備后期檢測(cè)。標(biāo)本來(lái)源的病人中,男27例,女23例,平均年齡(61.00±14.48)歲。

1.2 方法

1.2.1 QRT-PCR:應(yīng)用TaKaRa試劑盒提取腫瘤組織總RNA,測(cè)定RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)體系中, 20 μl含總RNA 1000 ng、5×PrimeScript RT Master Mix以及RNase Free H2O,冰上配置,混勻,37 ℃反應(yīng)15 min,85 ℃反應(yīng)5 s,最后4 ℃取出。目的基因Gαi1、Gαi2、Gαi3及內(nèi)參照GAPDH引物(HQP007747、HQP007748、HQP007749、HQP006940)均由廣州復(fù)能基因有限公司合成并提供。以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參照, 10 μl體系中含2×SYBR? Premix Ex Taq 5 μl,cDNA模板1 μl,上下游混合引物1 μl,RNase Free H2O 3 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性(1個(gè)循環(huán))95 ℃ 30 s;PCR 反應(yīng)(40個(gè)循環(huán))95 ℃ 5 s,60 ℃ 30～34 s。2^-ΔΔCT法比較mRNA表達(dá)差異。

1.2.2 免疫組化染色:兔抗人 Gαi1、Gαi2、Gαi3多克隆抗體(sc-391 、sc-7276 、sc-262)購(gòu)自美國(guó) santa cruz公司。氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自DAKO公司。取石蠟包埋標(biāo)本,切片,二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水。EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH 9.0)進(jìn)行抗原修復(fù),PBS沖洗;3%過(guò)氧化氫處理,室溫避光孵育25 min,PBS沖洗;滴加正常封閉血清,室溫孵育30 min,傾去多余液體,滴加相應(yīng)的第一抗體工作液(陰性對(duì)照采用PBS),濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜;PBS沖洗,傾去多余液體,滴加生物素標(biāo)記的第二抗體室溫孵育50 min, PBS沖洗;滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時(shí)間,陽(yáng)性為棕黃色,自來(lái)水沖洗切片終止顯色;蘇木素輕度復(fù)染3 min,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封固。蘇木素復(fù)染核為藍(lán)色,DAB顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。Gαi低表達(dá)指著色深度低于正常組織，Gαi高表達(dá)指著色深度高于正常組織。

1.2.3 Western-blot:取10 mg組織,液氮研磨,加入含PMSF的RIPA裂解液200 μl,冰上超聲破碎組織若干次,4 ℃,12 000 r/min,離心2 min,吸取上清,BCA法測(cè)蛋白濃度,取等量蛋白,加入5×SDS上樣緩沖液混勻,100 ℃變性5 min。配制10%的分離膠和5%的積層膠,蛋白上樣30 μg,SDS-PAGE垂直凝膠電泳,PVDF膜橫流250 mA濕轉(zhuǎn)110 min,5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗4 ℃孵育過(guò)夜。取出PVDF膜,TBST清洗3次,每次5 min;辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ig-G二抗,室溫孵育1 h,洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá),應(yīng)用Image Lab軟件半定量分析特異性條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌及切緣正常組織中Gαi的表達(dá) QRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織中Gαi1(t=4.400,P<0.05)、Gαi2(t=4.726,P<0.01)、Gαi3(t=6.556,P<0.01)mRNA水平相對(duì)于配對(duì)切緣正常組織表達(dá)明顯下調(diào),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1。

2.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中Gαi的表達(dá)明顯低于配對(duì)切緣正常組織,Gαi陽(yáng)性表達(dá)最明顯區(qū)域位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中,呈現(xiàn)為棕黃或棕褐色。相對(duì)于配對(duì)切緣正常組織,結(jié)直腸癌組織中僅有少量表達(dá)。見(jiàn)圖2。

注：與正常切緣比較，*P<0.05,**P<0.01圖1 2種組織中Gαi mRNA的表達(dá)(n=50)

圖2 2種組織中Gαi的免疫組化染色(×400)

2.3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果 24例(48%)病人腫瘤組織中Gαi1表達(dá)低于正常切緣;30例(60%)病人腫瘤組織中Gαi2表達(dá)低于正常切緣;31例(62%)病人腫瘤組織中Gαi3表達(dá)低于正常切緣;結(jié)直腸癌組織中Gαi2和Gαi3蛋白相對(duì)于Gαi1下降比例更高,與QRT-PCR結(jié)果略有差異，但大體趨勢(shì)一致,可能與病人基因翻譯個(gè)體差異有關(guān),見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)直腸癌中Gαi的表達(dá)

2.4 Gαi2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤T分級(jí)越差,TNM分期越高,腫瘤分化程度越差,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人,其Gαi2的表達(dá)水平越低,而與年齡、性別以及神經(jīng)轉(zhuǎn)移與否無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 Gαi2的表達(dá)與病人臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(n,n=50)

3 討論

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面,與配體結(jié)合后,偶聯(lián)下游異三聚體G蛋白發(fā)生變構(gòu),從而活化胞內(nèi)特異性信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)[6]。G蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)表面，是GPCR與胞內(nèi)效應(yīng)器鏈接的重要橋梁。Gαi自發(fā)現(xiàn)以來(lái)不斷受到人們的關(guān)注, Gαi最初被稱為抑制性G蛋白,包括Gαi1、Gαi2、Gαi3 3種密切相關(guān)的成員,活化后能夠抑制腺苷酸環(huán)化酶活性[7]。Gαi缺陷或基因突變能夠影響上皮頂突凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫自噬及細(xì)胞骨架重構(gòu)等多種生物學(xué)行為[5, 8-9]。Gαi與循環(huán)、神經(jīng)及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3],然而在腫瘤領(lǐng)域,尤其是結(jié)直腸癌領(lǐng)域目前仍處于初步探索階段[10]。Edwards等[11]、Gotlind等[12]研究發(fā)現(xiàn),抑制小鼠Gαi2基因可誘發(fā)腸炎甚至可進(jìn)展為相關(guān)性腸癌。在結(jié)直腸癌病人中可能存在Gαi亞基的功能缺失或表達(dá),且很有可能影響腫瘤的進(jìn)展及病人的預(yù)后[13]。

為進(jìn)一步確認(rèn)Gαi表達(dá)與老年結(jié)直腸癌的關(guān)系,此研究首先利用QRT-PCR、Western blot及免疫組化等方法,分別從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平綜合全面地分析和評(píng)估Gαi亞基的表達(dá)水平。QRT-PCR結(jié)果顯示,在mRNA水平上,正常切緣主要表達(dá)Gαi2、Gαi3基因及少量Gαi1,腫瘤組織中Gαi1、Gαi2、Gαi3顯著下調(diào)。在一定程度上反映了Gαi在腸癌中的表達(dá)情況。然而作為胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,Gαi亞基以蛋白的形式發(fā)揮其生物學(xué)功能。為進(jìn)一步探究Gαi亞基在腸癌中的表達(dá)情況,此研究應(yīng)用Western blot檢測(cè)蛋白水平上Gαi亞基的表達(dá)差異。結(jié)果顯示,蛋白質(zhì)水平上腫瘤組織中Gαi2、Gαi3下調(diào)的病人占總數(shù)60%或以上,而相對(duì)而言,在腫瘤組織中Gαi1下調(diào)的例數(shù)并不明顯,提示腫瘤病人體內(nèi)主要表現(xiàn)為Gαi2、Gαi3亞基的下調(diào)。

隨后通過(guò)對(duì)50例病人臨床資料的進(jìn)一步采集,并結(jié)合免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果顯示Gαi2的表達(dá)在老年人群中表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.079)，腫瘤T分期越差,TNM分期越高,腫瘤分化程度越差,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人,其Gαi2的表達(dá)水平越低。Gαi2的下調(diào)可能通過(guò)影響T分級(jí)、TNM分期、分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移進(jìn)而影響病人預(yù)后及生存期。

在此后的研究中將需要擴(kuò)大樣本例數(shù),完善細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以明確Gαi在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機(jī)制。

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Expression and clinical significance of Gαi protein in human colon carcinoma

YANJun-jun,ZHOUXi-qiao.DepartmentofGastroenterology;HUYao.

CenterofPET/CT;ZENGXiao-ning.DepartmentofRespiratory&CriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the expression of Gαi in human colon carcinoma and to determine its clinical significance. Methods QRT-PCR was used to detect the Gαi1、Gαi2、Gαi3 mRNA in 50 colon carcinoma and pared adjacent non-cancerous tissue, western blot was used to detect the expression of Gαi1、Gαi2、Gαi3 protein. The relationship between the expression of Gαi1、Gαi2、Gαi3 and the clinicopathological parameter and prognosis of these patients were analyzed by immunohistochemistry. Results The expression levels of Gαi1、Gαi2、Gαi3 mRNA and protein in colon carcinoma were lower than those in normal tissue (P<0.05). Immunohistochemistry results showed that Gαi1、Gαi2、Gαi3 expression was significant down-regulated in colon carcinoma tissue (P<0.05). Low expression Gαi2 was associated with larger tumor size(χ2=4.919,P=0.027), TNM stage(χ2=7.284,P=0.007)and lymphatic metastasis(χ2=4.468,P=0.035), as well as poor tumor differentiation(χ2=6.826,P=0.033). Conclusions The down-regulated expression of Gαi1、Gαi2、Gαi3 in colon carcinoma tissue is closely relate to T stage, TNM stage and poor tumor differentiation.

colon carcinoma; Gαi; expression

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81570522，81100274)

210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院消化科(嚴(yán)君君，周希喬)；PET/CT科(胡瑤)；呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科(曾曉寧)

周希喬，Email: Xiqiao_Zhou@126.com

R 735.35

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.05.007

2016-11-25)