周冬青

[摘要] 目的 研究一種改良的Masson染色方法用來顯示肝組織中膠原纖維，作為慢性乙型肝炎、肝硬化纖維化程度的病理分期標(biāo)準(zhǔn)，為臨床治療提供幫助。方法 方便選取2012年6月—2016年12月徐州市傳染病醫(yī)院病理室50例石蠟包埋肝組織切片，采用在傳統(tǒng)Masson染色基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的染色方法進(jìn)行膠原纖維染色，根據(jù)染色結(jié)果顯示慢性乙型肝炎及肝硬化肝組織中膠原纖維增生情況，作為病理診斷纖維化程度依據(jù)，染色結(jié)果與傳統(tǒng)染色方法進(jìn)行對比，并結(jié)合臨床資料，判斷病理診斷的分級、分期與臨床診斷的分度是否一致，來評價其應(yīng)用價值。結(jié)果 根據(jù)患者HE染色結(jié)果和改良的Masson染色顯示的膠原纖維染色結(jié)果，進(jìn)行慢性肝炎病理分級、分期診斷及肝硬化診斷，50例患者中慢性乙型肝炎輕度有6例（G1-2，S1-2），慢性乙型肝炎輕-中度（G2-3、，S2-3）及中度（G3、，S3）有36例，慢性乙型肝炎重度2例（G4S2），早期肝硬化2例（G3S4），肝硬化4例，結(jié)合患者臨床資料，根據(jù)染色結(jié)果作出的病理學(xué)診斷的分級、分期與患者的臨床分度基本一致，有2例患者臨床診斷為慢性乙型肝炎，經(jīng)染色后病理診斷為肝硬化。結(jié)論 改良Masson染色法與傳統(tǒng)染色方法染色結(jié)果對比切片背景清晰，膠原纖維色澤鮮艷，對比度強(qiáng)，能夠顯示較細(xì)小的膠原纖維，染色效果更好，能滿足臨床病理學(xué)診斷的纖維化分期要求，具有重要的應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞]改良Masson染色法；慢性乙型肝炎；肝硬化；病理學(xué)診斷

[中圖分類號] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）03（b）-0046-03

[Abstract] Objective To research a kind of modified Masson staining method used to show the collagen fibrils in liver tissue and provide help for the clinical treatment by using it as the pathological staging standards of chronic hepatitis B and liver cirrhosis fibrosis degree. Methods 50 cases of paraffin embedding hepatic tissue slices in the pathological room in our hospital from June 2012 to December 2016 were selected and dyed by collagen fibrils on the basis of the traditional Masson staining method， and the collagenous fiber hyperplasia in the chronic hepatitis B and liver cirrhosis liver tissues were showed according to the staining results， as the basis of diagnosis of fibrosis degree， and the staining method and the traditional staining method was compared and whether the pathological diagnosis grading and staging was consistent with the clinical diagnosis division were determined according to the clinical data and its application value was evaluated. Results The HE staining results and modified Masson staining results showed that in the 50 cases of patients， there were 6 cases with mild chronic hepatitis B（G1-2，S1-2）， 36 cases with mild-moderate chronic hepatitis B （G2-3，，S2-3）- （G3，，S3）， 2 cases with severe chronic hepatitis B （G4S2）， 2 cases with early liver cirrhosis（G3S4） and 4 cases with cirrhosis and the pathological diagnosis grading and staging according to the staining results was basically consistent with the clinical grading， and 2 cases were diagnosed with chronic hepatitis B and diagnosed with liver cirrhosis after dyeing. Conclusion Compared with the traditional staining method， the slice background of modified Masson staining method is clear， the color of collagen fibrils is bright， and the contrast is strong， which can show the tiny collagen fibers， and the staining effect is better， and it can meet the clinical pathological diagnosis fibrillation staging requirements with important application value.

[Key words] Modified Masson staining method； Chronic hepatitis B； Liver cirrhosis； Pathological diagnosis

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）感染肝細(xì)胞后激發(fā)免疫反應(yīng)引起的慢性炎癥，全球約3.5億人曾感染過HBV，我國每年約30萬人死于與HBV相關(guān)的肝臟疾病所致的肝硬化、肝癌等嚴(yán)重肝病[1]。HBV感染后，肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死，當(dāng)壞死范圍較小，主要依靠肝細(xì)胞再生即可達(dá)到修復(fù)肝組織的目的，當(dāng)壞死范圍較廣，患者需要通過纖維化進(jìn)行修復(fù)，許多研究表明，肝活檢病理學(xué)檢查在顯示肝臟實(shí)質(zhì)損害的炎癥活動度與纖維化程度方面是金標(biāo)準(zhǔn)[2-8]，我國慢性乙型肝炎防治指南已將肝纖維化程度列入乙肝分級、分期的標(biāo)準(zhǔn)，作為病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)[9]，目前國內(nèi)顯示用來纖維化的膠原纖維染色常用傳統(tǒng)Masson染色方法、天狼猩紅苦味酸染色方法等，傳統(tǒng)的Masson三色染色方法，操作較繁瑣，而且膠原纖維染色較暗不太鮮艷[10] ；而天狼猩紅苦味酸染色方法需要偏光顯微鏡，一般實(shí)驗(yàn)室無法做到。為此，選取2012年6月—2016年12月徐州市傳染病醫(yī)院病理室的50例肝活檢標(biāo)本石蠟包埋組織試圖建立一種改良的Masson染色方法用來顯示膠原纖維，以達(dá)到提高染色的質(zhì)量和工作效率的目的，為慢性肝炎纖維化程度分期及肝硬化患者的病理診斷提供可靠依據(jù)，也為臨床精準(zhǔn)診療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取的50例慢性乙型肝炎、肝硬化患者石蠟包埋組織切片來源為徐州市傳染病醫(yī)院病理室的肝活檢標(biāo)本，所有患者均根據(jù)2015年《中國慢性乙肝防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)具有明確診斷，切取石蠟包埋切片4～6 μm。

1.2 試劑：

1.2.1 0.5%酸性高錳酸鉀 0.5%高錳酸鉀溶液90 mL加入3%的硫酸10 mL。

1.2.2 1%草酸 草酸1 g，蒸餾水100 mL。

1.2.3 0.6%變色酸2R 變色酸2R 0.6 g 、磷鉬酸0.4 g、蒸餾水100 mL。

1.2.4 0.2%冰醋酸 0.2 mL冰醋酸、蒸餾水100 mL。

1.2.5 0.4%磷鎢酸 磷鎢酸0.4 g、蒸餾水100 mL。

1.2.6 1%～2%苯胺藍(lán) 苯胺藍(lán)1～2 g，蒸餾水100 mL。

1.3 操作方法

常規(guī)石蠟切片脫蠟至水洗，放入酸性高錳酸鉀中氧化5 min后，自來水沖洗1～2 min，放入草酸中5 min漂白，自來水沖洗后放入蒸餾水中洗滌1 min，用變色酸2R試劑染色5 min，0.2%冰醋酸洗滌，入0.4%磷鎢酸中分化5 min，傾去余液放入1%～2%苯胺藍(lán)染色5 min，再用0.2%冰醋酸水洗滌，不用脫水（防褪色），采用吹風(fēng)機(jī)吹干后放入二甲苯中透明后封片。

2 結(jié)果

與傳統(tǒng)Masson三色染色法染色結(jié)果對比切片背景清晰，膠原纖維色澤鮮艷，對比度強(qiáng)，能夠顯示較細(xì)小的膠原纖維，染色效果更好（見圖1）。根據(jù)患者HE染色結(jié)果和改良的Masson染色顯示的膠原纖維染色結(jié)果，進(jìn)行慢性肝炎病理分級、分期診斷及肝硬化診斷，50例患者中慢性乙型肝炎輕度有6例（G1-2，S1-2），慢性乙型肝炎輕-中度（G2-3、，S2-3）及中度（G3、，S3）有36例，慢性乙型肝炎重度2例（G4S2），早期肝硬化2例（G3S4），肝硬化4例，結(jié)合患者臨床資料，根據(jù)染色結(jié)果作出的病理診斷的分級、分期與患者的臨床分度基本一致。慢性乙型肝炎患者纖維化程度與炎癥活動度分級相關(guān)，患者肝組織纖維化程度的改變能反映出患者肝組織炎癥程度的變化。另有2例患者臨床診斷為慢性乙型肝炎，經(jīng)染色后病理診斷為早期肝硬化，通過改良Masson染色方法不但可以發(fā)現(xiàn)早期隱匿性肝硬化，還可以為慢性肝炎患者的病理學(xué)分級、分期診斷提供可靠的依據(jù)，慢性乙型肝炎患者肝組織纖維化程度與肝組織炎癥活動密切相關(guān)，在慢性乙型肝炎及肝硬化病理學(xué)診斷和臨床治療過程中具有重要的意義。

3 討論

改良Masson染色能清晰地顯示肝硬化患者肝組織中較細(xì)小的膠原纖維（膠原纖維呈亮藍(lán)色），顏色鮮艷，對比度好，步驟少，效率高；傳統(tǒng)的Masson三色染色方法，雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但是操作較繁瑣，而且膠原纖維染色不太鮮艷，且容易褪色；與之對比改良Masson染色效果更好，根據(jù)患者HE染色結(jié)果和改良的Masson染色顯示的膠原纖維染色結(jié)果，進(jìn)行慢性肝炎病理分級、分期診斷及肝硬化診斷，50例患者中慢性乙型肝炎輕度有6例（G1-2，S1-2），慢性乙型肝炎輕-中度（G2-3，S2-3）及中度（G3，S3）有36例，慢性乙型肝炎重度2例（G4S2），早期肝硬化2例（G3S4），肝硬化4例，結(jié)合患者臨床資料，根據(jù)染色結(jié)果作出的病理診斷的分級、分期與患者的臨床分度基本一致，有2例患者臨床診斷為慢性乙型肝炎，經(jīng)染色后病理診斷為肝硬化，因此可以作為慢性肝炎患者的病理學(xué)分級、分期診斷提供可靠的依據(jù)，對慢性乙型肝炎的治療具有重要的參考價值，而且能夠早期發(fā)現(xiàn)隱匿性肝硬化，在乙型肝炎及肝硬化病理檢查應(yīng)用中值得應(yīng)用推廣。李楚天等[11]用網(wǎng)狀纖維染色和Masson染色研究496例慢性肝炎患者纖維化程度與炎癥活動度分級相關(guān)性，結(jié)果表明慢性肝炎患者肝組織纖維化程度的改變能反映出患者肝組織炎癥程度的變化，這與我們的研究結(jié)果一致，但傳統(tǒng)的Masson染色過程中需要用VG鐵蘇木素液染胞核，鹽酸酒精分化，染色結(jié)束后用酒精脫水、透明后封固；經(jīng)過改良的Masson染色，在傳統(tǒng)的方法基礎(chǔ)上減去了VG鐵蘇木素液染胞核，鹽酸酒精分化步驟，增加了酸性高錳酸鉀氧化和草酸漂白處理后染色，用變色酸2R及苯胺藍(lán)染色結(jié)束后用吹風(fēng)機(jī)吹干代替酒精脫水，省略了傳統(tǒng)方法VG蘇木素染色、酒精梯度脫水的步驟，避免了藍(lán)色的膠原纖維經(jīng)酒精脫水引起的脫色，節(jié)約了時間和成本，同時簡化了操作步驟，提高了效率。與洪少君等[12]改良Masson染色法相比，該改良的Masson染色法省略了Harris蘇木素染細(xì)胞核及鹽酸乙醇分化的步驟，增加了酸性高錳酸鉀氧化和草酸漂白處理，使切片去除了其他色素的影響，使切片背景清晰，亮藍(lán)色的膠原纖維色澤鮮艷，對比度強(qiáng)，能夠顯示較細(xì)小的膠原纖維，用來顯示肝組織中膠原纖維，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，值得推廣，在慢性乙型肝炎及肝硬化病理學(xué)診斷及研究乙型肝炎病毒致病機(jī)制中具有重要的應(yīng)用價值。迄今為止，肝活檢病理學(xué)檢查使用Masson染色顯示膠原纖維仍然是判斷肝臟纖維化程度方面的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于肝活檢是一種有創(chuàng)的檢查，因此，有學(xué)者試圖檢測外周血單個核細(xì)胞纖維蛋白表達(dá)（Fibrosin-mRNA）水平來判斷肝纖維化程度，但是此項(xiàng)指標(biāo)能否替代肝活檢Masson染色，尚需進(jìn)一步大量研究才能證實(shí)[13]。

綜上所述，改良Masson染色用于顯示慢性乙型肝炎、肝硬化肝組織中的膠原纖維效果好，在慢性乙型肝炎及肝硬化病理學(xué)診斷及研究乙型肝炎病毒致病機(jī)制中具有重要的應(yīng)用價值，為臨床精確診斷和精準(zhǔn)治療方面提供可靠的依據(jù)，具有重要的意義。鑒于本研究只是個人的初步探索，下一步將擴(kuò)大樣本含量，進(jìn)一步改良染色方法，使膠原纖維染色達(dá)到更好的效果，以便更好地明確患者纖維化程度，為抗纖維化治療提供確切的依據(jù)。

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