潘雪嬌　曲曉華　劉宇　王守現(xiàn)

摘要：以1株大環(huán)柄菇屬野生菌為研究對象，依據(jù)形態(tài)學和分子生物學特征鑒定為高大環(huán)柄菇。通過測定菌絲生長速度、菌絲體干質量和生長勢等指標，研究其生物學特性。結果表明，該菌菌絲生長的最適碳源為淀粉，最適氮源為大豆蛋白胨；菌絲生長適宜的碳氮比為（10～30）：1，最適碳氮比為20：1；最適生長因子為維生素B₁；菌絲生長適宜溫度為24～28℃，最適溫度為28℃；最適pH值為7.0。

關鍵詞：高大環(huán)柄菇；鑒定；組織分離；碳氮比；生長因子；生物學特性

中圖分類號：S646.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0199—03

高大環(huán)柄菇（Macrolepiota procera）別稱高腳環(huán)柄菇、高柄環(huán)菇、棉花菇等，國外別稱陽傘蘑菇，在分類上屬于真菌門擔子菌亞門層菌綱傘菌目蘑菇科大環(huán)柄菇屬。夏秋季節(jié)于林中地上或草地上單生至散生、稀群生一起，是主要分布于亞熱帶地區(qū)的一種大型腐生菌，也是一種土生的食用菌。子實體一般大型，菇柄粗長；質地脆嫩，風味宜人，食味較美，含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素及礦物質等，尤以人體必需氨基酸含量高而著稱，是一種很有開發(fā)前景的食用菌新品種。目前，國內外關于高大環(huán)柄菇的人工栽培已有相關報道，Boyer研究發(fā)現(xiàn)可用雙孢菇堆肥進行人工栽培，丁智權等也報道了其栽培技術，但關于高大環(huán)柄菇的大面積推廣應用仍未見報道，究其原因為當前對該菌的研究不深人、缺乏基礎數(shù)據(jù)來支撐其配套栽培技術。因此，為更好地開發(fā)利用這一野生菌，筆者在前人研究的基礎上，采用菌絲生長速度、菌絲體干質量和生長勢等指標對1株野生高大環(huán)柄菇的生物學特性進行研究，篩選出最佳的生長條件，為其人工栽培及推廣應用提供技術支撐。

1材料與方法

1.2野生菌母種分離

2014年8月25日在吉林省白河林業(yè)局黃松蒲林場采集一種大環(huán)柄菇屬真菌，組織分離獲得該野生菌的母種。

1.3野生菌株鑒定

1.3.1形態(tài)學鑒定 肉眼觀測野生子實體的外表形態(tài)以及周圍生境。觀察菌絲體在固體培養(yǎng)基上菌落的形狀、大小、顏色、味道、生活力等。光學顯微鏡觀測擔孢子形態(tài)，并采用平板斜插蓋玻片法觀測菌絲鎖狀聯(lián)合結構、細胞大小、形態(tài)等。

1.3.2分子鑒定 利用ITS1和ITS4通用引物對分離的野生菌株進行ITS-PCR鑒定。

1.4野生高大環(huán)柄菇的生物學特性研究

碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值等試驗參照文獻[7—9]中的方法。

1.5測定方法

1.5.1菌絲的平均生長速度 將黃傘菌種接種于平板培養(yǎng)基表面的中央，培養(yǎng)8 d后測量菌落半徑，以菌落平均半徑除以時間即為菌絲的日平均生長速度。

1.5.2菌絲干質量 將測定完生長速度的平皿放人高壓鍋內121℃加熱至培養(yǎng)基融化（10 min），趁熱將菌絲取出置于單層紗布上，熱水浴1 h，然后置于烘干箱內105℃烘干至恒質量，稱量。

1.5.3生長勢的測定 菌絲生長濃密、長勢旺盛，用“+++-4-”表示；菌絲生長較密、長勢較好，用“+++”表示；菌絲生長密、長勢一般，用“++”表示；菌絲生長稀、長勢較弱，用“+”表示；菌絲不生長，用“-”表示。

2結果與分析

2.1野生菌株的鑒定結果

2.1.1形態(tài)學鑒定結果 子實體（圖1）一般大型，菌蓋直徑17～30 cm，中部褐色，有銹褐色鱗片；菌肉白色，較厚；菌褶白色，較密，離生，不等長；菌柄長15～38 cm，粗0.6～2.0 cm，柱形，向下漸粗，褐色，略扭轉，基部膨大，有可移動菌環(huán)；孢子印白色，孢子無色，光滑，卵圓形，（13～18）μm×（10～12）μm。

2.1.2分子鑒定結果 利用ITSl和ITS4通用引物對野生菌株進行擴增、測序。對測序結果進行BTJAST比對，發(fā)現(xiàn)目標序列與登錄號為HMl25514.1的高大環(huán)柄菇菌株同源性達到99.85%。因此，結合子實體形態(tài)可確定分離菌株為高大環(huán)柄菇。野生高大環(huán)柄菇菌株的ITS序列為：5′-TTTGAGGTCAATTTTCAGTATAATrGTCCATGAAGACTGGACGATTGGCAGCTGAACAGACAGAGAGCGACCACACGGCGTAGATAATTATCACACCTGTGACGGATCGCAAACGGTTCCGCTAATGCATTTCAGAGTAGCTGACCTTTAAAAGGCCAGCAAACCTCCATATCCAAGCCCCATCACAGAAAACTGGAGGGGTTGAGAATTTAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATAGATCATTTATAGGCACAAAGGCCCATTGAATACATTCTACAACATACTATGTGGTATATGAAAACATAGACTCCAGGGAAGGTTCACAACCATTTGAGGAGAGCTGCACTTTTTTTTTTGCGCAAGCATTCCTCACATCCGAGAAGACTCGATAGGTGGCTGCTCTCAATCCCTAGAAGACTACAAAAGGTGCACAGGTGGATGAATAAAAAACAAGACAGGTGTGCACAATGCCCCGGAGAGCCAGCTACAACCCATCAAGTATATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAA-3′。

2.2野生高大環(huán)柄菇的生物特性試驗結果

2.2.1碳源對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響 試驗結果（表1）表明，高大環(huán)柄菇菌株對供試碳源都能利用，但不同碳源問高大環(huán)柄菇菌絲生長速度、菌絲體干質量和長勢差異顯著。其中，該菌株在對照培養(yǎng)基和以淀粉、蔗糖和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上日生長速度較快，但差異不顯著；在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上，菌絲生長勢旺盛，干質量最高，達0.038 8 g，且與其他3種碳源差異顯著。因此，本試驗選取的最佳碳源為淀粉。

2.2.2氮源對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響 試驗結果（表2）表明，高大環(huán)柄菇菌株在不同氮源培養(yǎng)基上的生長速度差異顯著。菌絲生長速度以大豆蛋白胨最快；其次是酵母浸粉；最慢的是對照。從菌絲干質量來看，牛肉浸膏最高；其次是大豆蛋白胨；大豆粉最差。從菌絲生長勢來看，以大豆蛋白胨為氮源的菌絲濃密，長勢最佳；其次為酵母浸粉；大豆粉和對照最差。因此，本試驗選用大豆蛋白胨作為最佳氮源。

2.2.3碳氮比對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響 由表3可以看出，不同碳氮比對高大環(huán)柄菇菌絲生長影響明顯。高大環(huán)柄菇菌絲在碳氮比為（10～60）：1范圍內均可生長，但以（10～30）：1生長較適宜，在此之間菌絲生長速度較快且差異不顯著。碳氮比在（50～60）：1之間，菌絲生長緩慢。從菌絲干質量來看，碳氮比為10：1時，菌絲干質量較高但與碳氮比為20：1的培養(yǎng)基差異不顯著；碳氮比在（50～60）：1之間，菌絲干質量最差。因此，本試驗選用碳氮比為20：1。

2.2.4生長因子對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響 試驗結果（表4）表明，不同生長因子對高大環(huán)柄菇菌絲生長存在一定的影響，其中維生素B₁、維生素B₂和肌醇的菌絲生長速度最快，且三者之間差異不顯著；維生素C最差。從菌絲干質量來看，維生素B₂、肌醇、維生素B₁和玉米漿的菌絲體干質量較高，且四者問差異不顯著；維生素C最低。因此，本試驗選維生素B₁作為最佳生長因子。

2.2.5溫度對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響 試驗結果（表5、圖2）表明，不同溫度處理對高大環(huán)柄菇菌株生長速度具有顯著的影響。在16～32℃之間菌絲均能正常生長，但24～28℃最適宜，其中在28℃時菌絲生長速度、菌絲體干質量、生長勢均較優(yōu)；當溫度低于24℃時，雖然菌絲仍然潔白稠密，但生長速度減慢；當溫度達到36℃時，菌絲完全停止生長。因此，本試驗選取的最適培養(yǎng)溫度為28℃。

2.2.6 pH值對高大環(huán)柄菇菌絲生長的影響 從表6可以看出，高大環(huán)柄菇菌絲在pH值為5.0～8.5之間均能生長；當pH值大于8.5時，高大環(huán)柄菇菌絲不能生長。在pH值為5.0、7.0時，菌絲生長較快，且差異不顯著。從菌絲體干質量來看，pH值為5.0、6.0時，菌絲體干質量較高，且兩者之間差異不顯著。從菌絲生長勢來看，當pH值為7.0時，菌絲長勢最旺；其次是pH值為5.0、6.5；菌絲在pH值為8.0～8.5之間時長勢較弱；當pH值為9.0時，菌絲不能生長。因此，本試驗選取的最適pH值為7.0。

3結論與討論

在歐洲、亞洲和非洲的許多國家和地區(qū)，高大環(huán)柄菇是很名貴的菌類，該菌不但適于鮮銷，還適于制罐或制干，因菇柄粗且長，干物質含量高，是很好的加工原料，具有很高的推廣價值。目前，關于大型真菌的生物學特性的研究報道較多，但多數(shù)以菌絲生長速度和生長勢作為衡量指標，篩選其最適生長條件。菌絲干質量是指菌株利用碳源、氮源等營養(yǎng)成分，合成自身結構物質烘干后的質量；在一定程度上可以反映菌株利用營養(yǎng)成分的強弱，作為菌株健壯程度的評價標準。本研究采用菌絲日生長速度、菌絲體干質量和菌絲生長勢等指標對野生高大環(huán)柄菇菌株的生物學特性進行綜合分析評價，結果表明，該菌適合的碳源選擇比較廣，在以淀粉、蔗糖和山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長速度、菌絲干質量及生長勢都比較好，該結果與馮飛等報道的一種大環(huán)柄菇屬（Macrolepiota sp.）真菌的最適碳源一致，結合菌絲干質量，選擇淀粉為最適碳源；在氮源利用方面，該菌對氮源的選擇比較窄，最適氮源為大豆蛋白胨，這與荷葉離褶傘、黃傘菌株的最適碳源一致；適宜的碳氮比為（10～30）：1，最適碳氮比為20：1；最適生長因子為維生素B₁，這與馮飛等報道的結論一致；高大環(huán)柄菇菌絲體生長適宜的溫度范圍為24～28℃，最適溫度為28℃，這與馮飛等報道的最適溫度為25℃不一致，主要可能是因為試驗所采用的培養(yǎng)箱精密度不一樣，筆者近年來研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)食用菌的最適生長溫度為28℃；最適pH值為7.0，該結論與丁智權報道的最適pH值為6.5～7.2相吻合。目前，未見其他關于高大環(huán)柄菇最適氮源、碳源、碳氮比及最適生長因子的綜合研究報道，本研究結果可為高大環(huán)柄菇的人工栽培及推廣應用提供一定的依據(jù)。