郜衛(wèi)華　田羅　黃廷華　姚敏　許巧情

摘要：利用RACE技術(shù)，克隆了凡納濱對(duì)蝦鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）基因（GenBank登錄號(hào)：JQ682618）。該基因（LvCRT）cDNA全長(zhǎng)1866 bp，含有1個(gè)長(zhǎng)達(dá)1 221 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼的成熟肽由406個(gè)氨基酸組成，5′UTR（5′非編碼區(qū)）長(zhǎng)度為222 bp，3′UTR長(zhǎng)度為423 bp，3′端加尾信號(hào)AATAAA位于poly（A）尾巴上游27 bp處。預(yù)測(cè)其理論分子量是15.3 ku，等電點(diǎn)pI為4.90。具有1個(gè)保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽（KHEQNIDCGGGYLKVF），1個(gè)信號(hào)肽（MKTWVFLALFGVVLVES）和保守的HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收標(biāo)簽。經(jīng)NCBI BLASTX比對(duì)表明，LvCRT基因與中國(guó)明對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的LvCRT具有高度的相似性和一致性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，LvCRT在親緣關(guān)系上更接近昆蟲的鈣網(wǎng)蛋白基因。熒光定量PCR結(jié)果顯示CRT在肌肉組織中表達(dá)量最低，在腸中的表達(dá)量最高。對(duì)凡納濱對(duì)蝦CRT基因全長(zhǎng)cDNA序列克隆和表達(dá)的研究為更進(jìn)一步了解CRT多肽在凡納濱對(duì)蝦中的重要功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦；鈣網(wǎng)蛋白；基因克隆；表達(dá)

中圖分類號(hào)：S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0036—05

鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）最初是由Ostwald等在兔肌肉細(xì)胞的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被發(fā)現(xiàn)的。近年來(lái)研究表明，CRT不僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，在細(xì)胞表面和胞外基質(zhì)中都有表達(dá)。Luan等研究表明，CRT在中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenae-us chinensis）肝胰腺、鰓、肌肉、腸、淋巴器官、血細(xì)胞和卵巢中均有表達(dá)，其中卵巢的表達(dá)量最高。成熟的鈣網(wǎng)蛋白包括3個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域：N-功能域負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)底物蛋白，P-功能域和C-功能域可以結(jié)合鈣離子并使這種結(jié)合更加穩(wěn)定。目前為止，已公布的甲殼動(dòng)物的鈣網(wǎng)蛋白序列包括中國(guó)明對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis（DQ323054）、斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon（HQ259085）和克氏原螯蝦Pacifastacus leniusculus（HQ596362）。

作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，鈣網(wǎng)蛋白除了在細(xì)胞功能中扮演重要的作用，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子平衡和分子伴侶功能外，還參與了包括生長(zhǎng)、繁殖、蛻皮、免疫功能、細(xì)胞凋亡和氧化及脅迫響應(yīng)的多種生物學(xué)過程。本研究根據(jù)長(zhǎng)期低鹽誘導(dǎo)消減cDNA文庫(kù)中差異表達(dá)基因的同源序列和RACE方法，克隆了凡納濱對(duì)蝦CRT（LvCRT）基因，并利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其組織特異性表達(dá)進(jìn)行了的分析，以期為凡納濱對(duì)蝦脅迫生理相關(guān)基因的克隆研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用蝦購(gòu)自廣東海興農(nóng)生物科技有限公司，于廣東海洋大學(xué)東海島實(shí)驗(yàn)基地水泥池暫養(yǎng)1周，取健康凡納濱對(duì)蝦，經(jīng)滅菌DEPC水清洗后，先將其冰浴麻醉，冰浴條件下分離血細(xì)胞、肌肉、肝胰腺、腸道和鰓共5種組織，迅速裝入1.5 mLeppendoff離心管（RNase free），并立即投入液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA的提取

取凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞、肌肉、肝胰腺、腸道和鰓共5種組織，按照聯(lián)合基因的Unizol Reagent（GENEray biotechnology，China）的操作步驟，研磨、裂解組織后提取總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計(jì)對(duì)提取的組織總RNA進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

1.3 LvCRT cDNA全長(zhǎng)克隆

1.3.1 LvCRT cDNA片段的獲得 根據(jù)構(gòu)建的消減cDNA文庫(kù)得到的LvCRT的EST序列（146 bp）和中國(guó)明對(duì)蝦CRT保守序列，重新應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)正反向引物（LvCRTF1/LvCRTR1）克隆中間片段，本試驗(yàn)中所有引物皆由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃60 s，57℃60 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒（OMEGA，USA）回收擴(kuò)增片段，回收后與Easy Digestion T-vector（pED-T）（Si-noBio，Shanghlai）載體連接，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。挑取陽(yáng)性克隆菌落送往深圳華大基因公司測(cè)序，將所得LvCRT基因cDNA中間序列于NCBI中進(jìn)行BLASTX同源性分析。

1.3.2 LvCRT cDNA 3′端和5′端的獲得 根據(jù)SMARTerTMRACE cDNA Ampllication Kit（Clontech，USA）和5′RACE Sys-tem for Rapid Amplification of cDNA ends（Invitrogen，USA）試劑盒操作步驟，分別擴(kuò)增LvCRT基因cDNA的3′端和5′端序列，整個(gè)過程所需的引物序列見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，接下來(lái)的DNA回收、連接轉(zhuǎn)化、測(cè)序和同源性比對(duì)等步驟均同“1.3.1”節(jié)。

1.3.3序列分析 采用BioEdit軟件將中間序列、3′端序列和5′端序列拼接得到LvCRT基因全長(zhǎng)cDNA序列。設(shè)計(jì)正反向引物（LvCRTF/LvCRTR）對(duì)該基因進(jìn)行ORF開放閱讀框克隆以確保全長(zhǎng)的正確性。此過程采用Ex Taq DNA聚合酶，PCR反應(yīng)條件：95℃4min；95℃40 s，57℃1 min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。冰箱4℃保存。接下來(lái)的DNA回收、測(cè)序和同源性比對(duì)等步驟均同“1.3.1”節(jié)，所用引物序列見表1。

1.3.4 LvCRT cDNA全長(zhǎng)生物學(xué)信息分析 通過NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLASTX進(jìn)行蛋白序列同源性檢索；通過http：∥expasy.pku.edu.cn網(wǎng)站上的ExPASy軟件對(duì)該cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行序列開放閱讀框搜索、蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)和氨基酸序列的推斷等；通過http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網(wǎng)站上SignalP3.0軟件預(yù)測(cè)該基因的信號(hào)肽；通過Clustal W1.8軟件進(jìn)行氨基酸多重序列分析，再結(jié)合MEGA 4.0軟件用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹（Neighbour-Joining tree）。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 根據(jù)已克隆LvCRT基因和口一actin內(nèi)參基因，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量表達(dá)的特異性正反向引物L(fēng)vCRTF′/LvCRTR′和β-actinF′/β-actinR′（表1）。使用Fermentas RevertAidr^TMFirst StrandcDNA Synthesis Kit（MBI，LTU）試劑盒合成cDNA第一鏈。具體如下：在冰浴后PCR管中加入1μg總RNA和1μL Oligo-dT（15）（0.5μg/μL），然后再加入DEPC水配制成10μL體系，將反應(yīng)管置于PCR儀中，70℃預(yù)變性5 min，迅速置于冰上。變性反應(yīng)結(jié)束后再加入4μL5×First—strand緩沖液、2.0μL0.1 mo]/L DTF、1.0 μL RiboLock^TMRibonuclease inhib-itor和2.0μL dNTP mix（10 mmol/L）后將PCR管置于PCR儀中，37℃孵育5 min，再加入1μL SuperscriptⅡ（200 U/μL），將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，42℃孵育50 min，70℃變性10 min，4℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用SYBRμPremix Ex Taq^TM（TaKaRa，Japan）試劑盒在ABI 7500 Real Time Thermal Cycler熒光定量PCR儀（Applied Biosystem美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)）中進(jìn)行，定量數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)定量中的2-AACt法（Hvak和Schmittgen，2001）；使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析；用Turkey法進(jìn)行多重比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1 LvCRT全長(zhǎng)cDNA序列的克隆及分析

以凡納濱對(duì)蝦肝胰腺cDNA為模板，采用分段克隆方法和3′RACE、5′RACE法對(duì)CRT基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行克隆，得到全部中間序列（397 bp）（圖1）和3′末端（990 bp）、5′末端（742 bp）（圖2），采用BioEdit軟件去除重疊序列以及接頭序列后得到1866 bp的cDNA全長(zhǎng)序列，將獲得的凡納濱對(duì)蝦LvCRT cDNA全長(zhǎng)序列提交NCBI，GenBank登錄號(hào)為JQ68261 8。經(jīng)http：∥au.expasy.org/tools/dna.htmL在線軟件分析顯示，該基因具有1個(gè)長(zhǎng)達(dá)1 221 bp完整的開放閱讀框，1個(gè)起始密碼子（ATG）和1個(gè)終止密碼子（TAA），開放閱讀框編碼具有406個(gè)氨基酸的鈣網(wǎng)蛋白?；?′端非編碼區(qū)（5′-UTR）長(zhǎng)222 bp，3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）長(zhǎng)423 bp。3′端的加尾信號(hào)AATAAA位于poly（A）尾巴上游27 bp處。開放閱讀框進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果表明cDNA全長(zhǎng)序列的正確性（圖2）。經(jīng)http：∥web.expasy.org/compute_pi/在線分析，該蛋白分子量為15.3 ku，等電點(diǎn)pI為4.90。

2.2 LvCRT cDNA特征的分析

用http：∥/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網(wǎng)上SignalP3.0軟件在線預(yù)測(cè)該基因信號(hào)肽，結(jié)果顯示，該基因具有1個(gè)疏水信號(hào)肽（MKTWVFLALFGVVLVES），該信號(hào)肽位于氨基酸N端（圖3）。使用在線http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos軟件預(yù)測(cè)該基因蛋白磷酸化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白共有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中5個(gè)為Ser磷酸化位點(diǎn)，其氨基酸位點(diǎn)分別為27、76、83、124、191；11個(gè)為Thr磷酸化位點(diǎn)，其氨基酸位點(diǎn)分別為50、66、77、94、139、179、222、229、246、298、344；6個(gè)為Tyr磷酸化位點(diǎn)，其氨基酸位點(diǎn)分別為126、180、269、283、297和304（圖4）。

通過NCBI網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi）蛋白質(zhì)保守區(qū)的結(jié)果顯示，推測(cè)LvCRT中第19～330個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成了1個(gè)由311個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)，該保守區(qū)屬于鈣網(wǎng)蛋白家族。該基因還具有1個(gè)保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽（KHEQNIDCGGGYLKVF），該標(biāo)簽位于第95～111個(gè)氨基酸殘基之間。除此之外，還發(fā)現(xiàn)該基因具有1個(gè)鈣網(wǎng)蛋白家族的重復(fù)序列IxDxExxKPE（/D）DWD和1個(gè)保守的HDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收標(biāo)簽，這個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收標(biāo)簽位于氨基酸序列的c末端（圖5）。

2.3 LvCRT基因序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

使用ClustalW 1.83和MEGA 4.0軟件，選取中國(guó)明對(duì)蝦（ABC50166），斑節(jié)對(duì)蝦（AD000927），克氏原螯蝦（AEC₅₀079），意蜂Apis mellifera（XP_392689），岡比亞按蚊Anophelesgambiae（AAL68781），家蠶Bombyx mot/（BAC57964），黑腹果蠅Drosophila melanogaster（CAA45791），斑馬魚Danio rerio（Np_956007），小鼠Mus musculus（AAH03453），人Homo sapi-ens（NP_004334），擬南芥Arabidopsis thaliana（NP_176030），煙草Nicotiana tabacum（CAA59694），非洲爪蟾Xenopus laevis（CAA47866）13個(gè)物種的CRT氨基酸序列與凡納濱對(duì)蝦的CRT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。分析顯示，凡納濱對(duì)蝦全序列與斑節(jié)對(duì)蝦（ADQ28317）、中國(guó)明對(duì)蝦（ABC50166）、克氏原螯蝦（AEC50079）和黑腹果蠅（AAF54416）分別具有99%、99%、94%和81%的序列相似度，99%、97%、89%和69%的序列一致性（圖6）。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，構(gòu)建的分子進(jìn)化樹可以將CRT基因聚類分為植物、脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物3個(gè)分支，LvCRT位于無(wú)脊椎動(dòng)物CRT的一支，與昆蟲的CRT聚類在一起（圖7）。

2.4 LvCRT基因在組織中的表達(dá)分布

熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，LvCRT基因在凡納濱對(duì)蝦所檢測(cè)的組織包括肌肉、鰓、腸、肝胰腺和血細(xì)胞中均有表達(dá)（圖8），由高到低依次為：腸道>鰓>血細(xì)胞>肝胰腺>肌肉，腸道中表達(dá)量最高，顯著高于其他各組織；血細(xì)胞和肝胰腺問的LvCRT表達(dá)量無(wú)顯著性差異，但二者均顯著高于肌肉而低于鰓；肌肉表達(dá)量最低，顯著低于其他各組織。

3討論與結(jié)論

目前，鈣網(wǎng)蛋白的研究多集中在模式生物上，甲殼動(dòng)物中鈣網(wǎng)蛋白的研究相當(dāng)少。迄今為止，已公布的對(duì)蝦類鈣網(wǎng)蛋白序列僅包括中國(guó)明對(duì)蝦（DQ323054）、斑節(jié)對(duì)蝦（HQ259085）和克氏原螯蝦。

本研究以先前建立的鹽度脅迫誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦消減cDNA文庫(kù)為PCR模板，成功克隆到凡納濱對(duì)蝦的鈣網(wǎng)蛋白LvCRT基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行了氨基酸的預(yù)測(cè)和同源序列的比對(duì)分析。LvCRT基因與斑節(jié)對(duì)蝦（ADQ28317）、中國(guó)明對(duì)蝦（ABC50166）和克氏原螯蝦（AEC50079）具有99%、99%和94%的序列相似度，99%、97%和89%的序列一致性。LvCRT基因推導(dǎo)的氨基酸序列具有1個(gè)311個(gè)氨基酸組成的高度保守區(qū)和1個(gè)高度保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽（KHEQNIDCGGGYLKVF），這與欒偉報(bào)道的中國(guó)明對(duì)蝦FCCRT鈣網(wǎng)蛋白分子結(jié)構(gòu)極為相似，即與底物結(jié)合的相關(guān)的N-和P-2個(gè)功能域都非常保守，據(jù)此推測(cè)，LvCRT可能與之前報(bào)道的鈣網(wǎng)蛋白具有相似的分子伴侶功能。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，LvCRT位于無(wú)脊椎動(dòng)物CRT的一支，在親緣上接近于昆蟲的CRT。

以往的研究表明，鈣網(wǎng)蛋白作為重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，在病原感染、發(fā)育以及環(huán)境脅迫等情況下都對(duì)細(xì)胞起到重要的保護(hù)作用。鈣網(wǎng)蛋白最初被鑒定為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子結(jié)合蛋白，之后其作為分子伴侶蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)行使的眾多功能得到一一闡明。近期的研究結(jié)果又證明鈣網(wǎng)蛋白在免疫中扮演重要的作用，如吞噬、補(bǔ)體途徑、細(xì)胞粘連甚至自體免疫等過程。Johnson等研究表明，若缺乏CRT，小鼠胚胎的死亡會(huì)增高、細(xì)胞黏附活性會(huì)降低、細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感度增加、心肌的非正常發(fā)育會(huì)增加、非折疊蛋白的積累和錯(cuò)誤折疊會(huì)增加等。在哺乳動(dòng)物中，CRT在炎癥反應(yīng)和病原感染過程中起重要的作用。昆蟲中的CRT不僅參與早期的包囊作用，且很可能參與了昆蟲的免疫過程。Wang等在感染W(wǎng)SSV的中國(guó)明對(duì)蝦中，利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)CRT基因在感染6 h和瀕臨死亡的對(duì)蝦體內(nèi)會(huì)顯著上調(diào)表達(dá)。Duan等在感染鰻弧菌和WSSV的脊尾白蝦中發(fā)現(xiàn)，血細(xì)胞和肝胰腺在感染第1個(gè)6 h后CRT轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的上調(diào)表明其與免疫防御有關(guān)聯(lián)。欒偉發(fā)現(xiàn)在熱休克、重金屬脅迫和感染W(wǎng)SSV的中國(guó)明對(duì)蝦中，CRT轉(zhuǎn)錄表達(dá)會(huì)有明顯變化，且不同重金屬處理有不同的CRT轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。Visudtiphole等研究表明，斑節(jié)對(duì)蝦仔蝦血細(xì)胞的CRT基因在熱休克脅迫3 h后會(huì)顯著上調(diào)表達(dá)，可以作為斑節(jié)對(duì)蝦對(duì)熱應(yīng)激的分子生物標(biāo)記。結(jié)合本研究中鹽度脅迫的消減文庫(kù)中CRT基因的發(fā)現(xiàn)，表明LvCRT與環(huán)境脅迫之間存在一定關(guān)聯(lián)，未來(lái)可以作為一種環(huán)境脅迫或者種質(zhì)改良的分子標(biāo)記。