鐘向琴，丁亞琴，任樂樂，白 濤，，劉萌萌，劉云峰，章 毅

(山西醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、2.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西 太原 030001)

多巴胺對(duì)大鼠胰島素分泌的影響及機(jī)制研究

鐘向琴1，丁亞琴1，任樂樂1，白 濤1，2，劉萌萌1，劉云峰2，章 毅1

(山西醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、2.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西 太原 030001)

目的 研究多巴胺(dopamine,DA)對(duì)大鼠胰島素分泌的影響及可能機(jī)制。方法 ♂ SD大鼠的胰腺經(jīng)過膠原酶P消化、Histopaque 1077梯度離心后得到純化的胰島，Dispase Ⅱ?qū)⒁葝u消化為單個(gè)細(xì)胞。應(yīng)用胰島素分泌實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證DA對(duì)胰島素分泌的作用，通過膜片鉗技術(shù)和鈣成像技術(shù)記錄β細(xì)胞內(nèi)向性鈣電流、動(dòng)作電位時(shí)程和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，研究DA對(duì)大鼠胰島素分泌的作用機(jī)制。結(jié)果 在2.8 mmol·L-1的葡萄糖中，DA對(duì)胰島素的分泌沒有產(chǎn)生明顯的影響；在16.7 mmol·L-1的葡萄糖中，DA呈濃度依賴性抑制胰島素的分泌。DA干預(yù)后，抑制了胰島β細(xì)胞上內(nèi)向性鈣電流，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，減少了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。結(jié)論 DA通過抑制β細(xì)胞上內(nèi)向性鈣電流，進(jìn)而縮短了動(dòng)作電位的時(shí)程，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，最終抑制胰島素的分泌。

多巴胺；胰島β細(xì)胞；胰島素分泌；電壓門控性Ca2+通道；動(dòng)作電位；鈣成像

多巴胺(dopamine,DA)是一種主要由大腦分泌的神經(jīng)傳遞物質(zhì)，負(fù)責(zé)控制人的運(yùn)動(dòng)、情緒與感覺，并將興奮信息上傳，與精神和神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病密切相關(guān)[1]。研究表明[2]，在外周組織如腎臟、胰腺和上消化道中也可以合成并釋放多巴胺，調(diào)節(jié)非神經(jīng)系統(tǒng)的功能。由于外周多巴胺無(wú)法穿過血腦屏障，不會(huì)影響到神經(jīng)系統(tǒng)的功能，但是它可以在其合成的組織中發(fā)揮著旁分泌的作用。近年來，多巴胺與胰島素之間的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。臨床發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用多巴胺的前體左旋多巴治療帕金森疾病，這些病人通過口服糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖的耐受力明顯下降，這種現(xiàn)象在帕金森患病人群中高達(dá)50%～80%[3]。多巴胺被認(rèn)為可以影響胰島素的分泌[4]，然而其作用機(jī)制尚不明晰。本研究擬通過胰島素分泌實(shí)驗(yàn)以及膜片鉗、鈣成像技術(shù)，探究多巴胺對(duì)胰島素分泌的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,♂,由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180～250 g。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004。

1.2 試劑 Dopamine hydrochloride(美國(guó)Sigma，批號(hào)：BCBG8676V)；膠原酶P(瑞士Roche，批號(hào)：11104222)；BSA(北京索萊寶，批號(hào)：83100513)；RPMI 1640培養(yǎng)基(上海生工，批號(hào)：C518FA0002)；胎牛血清(上海生工，批號(hào)：B326FA0092)；青、鏈霉素(北京索萊寶，批號(hào)：20150909)；HEPES(北京索萊寶，批號(hào)：710B048)；Histopaque 1077(美國(guó)Sigma，批號(hào)：RNBF1783)；Dispase II(美國(guó)Amresco，批號(hào)：10888700)； D-葡萄糖(北京索萊寶，批號(hào)：405A0918)；胰島素檢測(cè)試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)：20160320)。

1.3 儀器 電子天平(上海精密儀器，型號(hào)：GB/T26497)；體式顯微鏡(上海中恒儀器,型號(hào)：SM262)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS, 型號(hào)：AE-2000)；臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀儀器, 型號(hào)：SC-3610)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京博奧恒信生物科技, 型號(hào)：HF100)；Narishige MODEL PP-830電極拉制儀(日本Narishige, 型號(hào)：PP-830)；MIRO FORGE MF-830拋光儀(日本Narishige, 型號(hào)：MF-200)；EPC10全自動(dòng)膜片鉗(德國(guó)HEKA, 型號(hào)：MP-285)；鈣成像(北京MDE, 型號(hào)：LAMBDA 10-B)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠胰島、胰島細(xì)胞的分離與培養(yǎng) ♂ SD大鼠斷頭處死后，將1 g·L-1膠原酶P溶液(RPMI 1640培養(yǎng)基溶解)緩慢注入到膽總管中,分離的胰腺經(jīng)37℃水浴消化、Histopaque 1077梯度離心得到單個(gè)胰島，并放于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分離胰島細(xì)胞時(shí)，使用5 g·L-1的Dispase Ⅱ酶液消化胰島，將細(xì)胞懸液均勻地接種在經(jīng)細(xì)胞黏附劑處理過的玻片上，加入培養(yǎng)液后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。

1.4.2 胰島素釋放實(shí)驗(yàn) 分得的單個(gè)胰島經(jīng)過夜修復(fù)后備用，每組7管，每管中放入5個(gè)胰島。首先，使用2.8 mmol·L-1葡萄糖孵育液37℃孵育30 min,棄除上清；然后，分別加入2.8 mmol·L-1和16.7 mmol·L-1葡萄糖孵育液以及含有不同濃度的DA孵育30 min,收集上清液，采用放免法測(cè)得胰島素含量；最后，加入乙醇粉碎胰島，測(cè)得胰島素的總含量。

1.4.3 膜片鉗實(shí)驗(yàn) 將分離的胰島細(xì)胞置于倒置顯微鏡下，細(xì)胞膜電容>7 pF的為β細(xì)胞。記錄電極經(jīng)PP-830電極拉制儀兩步法拉制，充滿電極內(nèi)液后電阻為4～7 MΩ,當(dāng)電極尖端與細(xì)胞膜之間形成高阻封接(≥1 GΩ)后，負(fù)壓破膜，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，形成全細(xì)胞記錄模式。記錄電壓門控性鈣電流時(shí)，在-70 mV鉗制電壓下給予-50 mV～30 mV的電壓刺激，記錄50 ms內(nèi)每次遞增10 mV的鈣電流。記錄動(dòng)作電位采用電流鉗模式，封接破膜后，給予150 pA、4 ms的電流注入，計(jì)算從去極化開始到復(fù)極化于靜息電位之上10 mV的時(shí)程為動(dòng)作電位時(shí)程[6]。

1.4.4 鈣成像實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞在37℃的環(huán)境下用2 μmol·L-1的Fura-2AM熒光探針染料染色約30 min。然后將細(xì)胞放置于激光共聚焦顯微鏡上，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm/380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm。以持續(xù)灌流的方式給予2.8 mmol·L-1葡萄糖(2.8 G)、16.7 mmol·L-1葡萄糖(16.7 G)和10 μmol·L-1DA(以16.7 G溶解)，F(xiàn)340/F380的比值反映灌流液體對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。該實(shí)驗(yàn)在30℃環(huán)境中進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 DA對(duì)大鼠胰島素分泌的影響 在2.8 mmol·L-1葡萄糖(2.8 G)和16.7 mmol·L-1葡萄糖(16.7 G)的基礎(chǔ)上分別加入不同濃度的DA(0、1、10 mmol·L-1)，孵育30 min后，檢測(cè)上清液中胰島素的含量。Tab 1結(jié)果顯示，在2.8 G的條件下，DA對(duì)胰島素的分泌沒有產(chǎn)生明顯的影響；在16.7 G的條件下，DA呈濃度依賴性抑制胰島素的分泌(P<0.01)。

Glucoseconcen?tration/mmol·L-1Dopamine/μmol·L-101102．8G12．498±3．05614．184±2．5489．042±1．18116．7G158．588±9．721##91．154±5．528?45．930±6．706??

##P<0.01vs2.8 G(DA 0 μmol·L-1);*P<0.05,**P<0.01vs16.7 G(DA 0 μmol·L-1)

2.2 DA對(duì)胰島β細(xì)胞電壓門控性鈣通道的影響 通過電壓鉗技術(shù)，在-70 mV的鉗制電壓下給予-50 mV～30 mV的電壓刺激50 ms，每次遞增10 mV檢測(cè)胰島β細(xì)胞上鈣電流。與對(duì)照組相比，DA(10 μmol·L-1)明顯地抑制了鈣電流[0 mV時(shí)，對(duì)照組(-3.963±0.406) pA/pF,DA組(-2.344±0.429) pA/pF,P<0.01]。見Fig 1。

2.3 DA對(duì)胰島β細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的影響 通過電流鉗技術(shù)，給予細(xì)胞150 pA、4 ms的電流注入，檢測(cè)給藥前后動(dòng)作電位時(shí)程的變化。與對(duì)照組相比，DA(10 μmol·L-1)明顯地縮短了動(dòng)作電位的時(shí)程(P<0.01)。見Tab 2。

GroupActionpotentialduration/msControl59．578±4．493TreatmentwithDA32．968±3．166??

**P<0.01vscontrol

2.4 DA對(duì)胰島β細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響 細(xì)胞在37℃的環(huán)境下使用2 μmol·L-1的Fura-2AM孵育約30 min，然后放置于340 nm/380 nm激發(fā)波長(zhǎng)，510 nm發(fā)射波長(zhǎng)下，測(cè)得DA對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。Fig 2結(jié)果顯示，DA使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度減少。以灌流初始值(F0)標(biāo)化后結(jié)果如下：2.8 G(0.036±0.001)，8.3 G(0.631±0.033)，DA(0.482±0.034)。

Fig 1 Effect of DA on voltage-gated calcium channels

A,B：Representative current traces recorded under the different treatment as indicated;C：Summary of the mean current density of Ca2+currents at 0 mV(n=6).**P<0.01vscontrol

3 討論

在生理?xiàng)l件下，葡萄糖是影響胰島素釋放最主要的因素。葡萄糖通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后，經(jīng)過糖酵解和氧化磷酸化生成ATP，ATP使細(xì)胞膜上的ATP敏感性鉀通道(KATP)關(guān)閉，細(xì)胞膜去極化，達(dá)到一定程度后，電壓依賴性鈣通道開放，外鈣內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，使成熟的分泌囊泡附著于微管微絲上，并通過兩者的相互作用促進(jìn)囊泡膜與細(xì)胞膜融合，最終誘導(dǎo)胰島素的釋放[7-8]。除此之外，外周的多種配體也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，如血管活性腸肽(VIP)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、乙酰膽堿(Ach)等。有數(shù)據(jù)顯示，多巴胺作為一個(gè)生理因子可以與β細(xì)胞上的多巴胺受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的分泌活動(dòng)[2,7,9]，外周多巴胺的異常會(huì)影響胰島素的正常調(diào)節(jié)。帕金森患者在治療過程中，通常使用左旋多巴和芐絲肼以提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多巴胺的濃度，并阻止外周左旋多巴轉(zhuǎn)換為多巴胺給機(jī)體帶來負(fù)面影響[10]，但在這一過程中仍然會(huì)有部分的多巴胺進(jìn)入到外周[2]，抑制葡萄糖刺激胰島素的分泌活動(dòng)，給胰島功能造成慢性的壓力，使得帕金森患者中糖耐量異常現(xiàn)象較為普遍[3,10]。因此，了解外周配體，尤其是多巴胺對(duì)于調(diào)節(jié)胰島素釋放的機(jī)制變得越來越重要。現(xiàn)今的文獻(xiàn)報(bào)道中，關(guān)于多巴胺對(duì)胰島素分泌的影響存在著爭(zhēng)議，有部分學(xué)者認(rèn)為多巴胺及其類似物可以抑制葡萄糖刺激胰島素分泌，而少部分認(rèn)為急性多巴胺的大量累積可以促進(jìn)胰島素的分泌[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)DA在16.7 G的基礎(chǔ)上明顯地抑制了胰島素的分泌，而在2.8 G的基礎(chǔ)上對(duì)胰島素的分泌活動(dòng)影響較小。電壓-電流曲線關(guān)系表明，DA抑制了電壓門控性鈣通道的開放，減小了鈣電流。通過給予150 pA、4 ms的電流注入，觀察細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的變化，結(jié)果表明，DA通過抑制鈣電流，加快動(dòng)作電位的復(fù)極化，明顯縮短了動(dòng)作電位的時(shí)程。DA干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，這可能與電壓門控性鈣通道被抑制有關(guān)。

Fig 2 Effect of DA on level of intracellular Ca2+ concentration

A: The trace shows the changes of intracellular Ca2+concentration in a representative cell perfused with 2.8,16.7 and 16.7 G+DA(10 μmol·L-1);B:The mean value of ΔF340/F380(Fmax-F0)in response to different treatments as indicated(n=6).##P<0.01vs16.7G;**P<0.01vs2.8G. The change of intracellular calcium[ΔF340/F380(Fmax-F0)] was determined by subtracting the initial F340/F380 ratio from the maximum F340/F380 for each treatment

我們推測(cè)，DA可能是通過抑制了鈣通道影響了胰島素的分泌。由于β細(xì)胞的動(dòng)作電位主要是由Ca2+通道和K+通道來產(chǎn)生的，是動(dòng)作電位去極化和復(fù)極化的主要離子通道，而動(dòng)作電位又可以直接調(diào)節(jié)胰島素的分泌活動(dòng)。本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DA抑制了電壓門控性Ca2+通道，使得動(dòng)作電位去極化幅度降低，復(fù)極增快，動(dòng)作電位時(shí)程縮短，細(xì)胞的興奮性下降；同時(shí)也使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度下降，分泌囊泡與細(xì)胞膜融合缺乏動(dòng)力，影響了囊泡的胞吐活動(dòng)，最終抑制了胰島素的分泌活動(dòng)。但關(guān)于K+通道是否也參與其中仍待進(jìn)一步的研究。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在山西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室章毅實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)人員表示感謝。)

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Effect of DA on insulin secretion from rat pancreatic cells and possible mechanism

ZHONG Xiang-qin1, DING Ya-qin1, REN Le-le1, BAI Tao1,2, LIU Meng-meng1, LIU Yun-feng2, ZHANG Yi1
(1.DeptofPharmacology,2.DeptofEndocrinologyoftheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

Aim To investigate the effects of dopamine(DA) on insulin secretion from rat islets and the possible mechanism.Methods Pancreatic islets were obtained from the pancreatic of male SD rats by collagenase P digestion and histopaque-1077 density gradient separation. Insulin secretion experiment was used to observe the change of insulin release after DA treatments. As to study the potential mechanisms of the effects of DA, patch-clamp experiment and calcuim image technique were applied to test the depolarization-evoked Ca2+currents, action potential duration and intracellular Ca2+concentration.Results In 2.8 mmol·L-1glucose, DA had no effect on insulin secretion; in 16.7 mmol·L-1glucose, dopamine inhibited insulin secretion in a dose-dependent manner. DA inhibited the inward calcium current, shorten the action potential duration, and reduced the intracellular Ca2+concentration.Conclusion DA inhibits insulin secretion maybe by decreasing the inward calcium current leading to shorten the action potential duration and reduce the intracellular Ca2+concentration.

dopamine hydrochloride; islet β cell; insulin secretion; voltage-gated calcium channels; action potential; calcuim image technique

2016-12-11,

2017-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81670710，81373464，81273564，81270882);山西省留學(xué)回國(guó)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助(No 2016-97);山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2013011047-3)

鐘向琴(1992-)，女，碩士生，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)，E-mail:1246131750@qq.com; 章 毅(1971-)，男， 博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: yizhang313@163.com; 劉云峰(1973-)，女， 博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病的治療及發(fā)病機(jī)制，通訊作者，E-mail: nectarliu@163.com

時(shí)間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.026.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.013

A

1001-1978(2017)05-0653-04

R-332；R322.57；R347.8；R348.1；R971.93