陳燕芬，陳景秀，孫 萌，丁俊垚，程澤能，胡高云，丁勁松，朱曲波

(中南大學湘雅藥學院，湖南 長沙 410013)

SM-1對人肝微粒體細胞色素P450亞型酶的抑制作用

陳燕芬，陳景秀，孫 萌，丁俊垚，程澤能，胡高云，丁勁松，朱曲波

(中南大學湘雅藥學院，湖南 長沙 410013)

目的 觀察SM-1對人肝細胞色素P450酶系統(tǒng)中7種亞型酶活性的影響。方法 在體外將一定濃度的底物或SM-1與人肝微粒體孵育30 min，分為對照組(底物)和實驗組(底物和SM-1)，以非那西丁、安非他酮、紫杉醇、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬、睪酮為CYP探針底物，應用HPLC法檢測各探針底物代謝量，計算抑制率，評價SM-1對人肝微粒體CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4 酶的抑制活性。結果 SM-1對CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4的抑制率分別是0.05%、3.37%、0.08%、2.07%、4.20%、-0.15%和10.84%。結論 SM-1對CYP3A4可能有抑制作用，臨床用藥時應注意因CYP酶抑制引起的藥物相互作用。

SM-1；細胞色素P450；底物；抑制率；肝微粒體；亞型酶

SM-1是根據(jù)PAC-1的構效關系，將其主要的藥效基團哌嗪環(huán)改為高哌嗪環(huán)而新合成的小分子化合物。化學結構式為[4-芐基-(1,4)二氮雜環(huán)庚烷-1-基]-乙酰(3-烯丙基-2-羥基-亞甲基苯)肼富馬酸鹽[1]。SM-1能特異性激活腫瘤細胞procaspase-3成為caspase-3，從而導致腫瘤細胞的快速死亡，而其對正常細胞活性影響小，是一種新型的非細胞毒特異性的抗腫瘤藥物[2]。

細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)是一個參與臨床藥物代謝的重要代謝酶系。近年來，中西藥間、西藥之間以及中藥復方的有效成分之間，基于細胞色素P450酶的誘導和抑制的作用，引起了很多臨床醫(yī)生和藥理學家的關注，也成為新藥開發(fā)的一個重要研究方向[3-6]。某一個藥物對CYP450 酶的誘導或者抑制，會影響合用藥物的藥代動力學，同服用的其他藥物的代謝可能被改變，這是引起藥物相互作用的一個重要因素[7-10]，進而會影響臨床用藥的安全性和有效性。值得注意的是，目前仍然沒有SM-1對CYP酶抑制活性的系統(tǒng)性研究。本文在人肝微粒體(human liver microsomes,HLM)的孵育體系中，系統(tǒng)評價了SM-1對CYP同工酶的抑制作用，為SM-1臨床前研究提供參考的實驗資料和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 SM-1(廣州南新藥業(yè)有限公司，含量≥99.40%，批號：15060101)、非那西丁(阿拉丁有限公司，含量≥98.0%，批號：H1428073)、安非他酮(上海畢得醫(yī)藥科技有限公司，含量>97.0%，批號：BD118984)、紫杉醇(美侖生物有限公司，含量>99.0%，批號：A0820A)、奧美拉唑(美侖生物有限公司，含量>99.0%，批號：20131005)、右美沙芬(南京森貝伽生物科技有限公司，含量>98.0%)、睪酮(上海源葉生物科技有限公司，含量>98.0%，批號：LM0514TA14)。人肝微粒體(BD公司，批號：5168001)、NADPH再生體系(Sigma公司，批號：1002065816)。色譜純乙腈和甲醇(美國默克公司)、純水(實驗室自制去離子水)。Agilent 1200型高效液相色譜儀(Agilent，德國)，配有色譜柱Agilent C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、數(shù)顯測速恒溫搖床SHA-B(蘇州威爾實驗用品有限公司)。

1.2 肝微粒體孵育實驗 實驗分組為：CYP酶探針底物、CYP酶探針底物+陽性抑制劑、CYP酶探針底物+受試藥、陰性對照組。孵育體系是200 μL，包括0.5 mmol·L-1K2HPO4/ KH2PO4緩沖溶液(pH 7.4)，含有1 mmol·L-1NADPH、HLM(蛋白含量0.5 g·L-1)、CYP酶探針底物、不同濃度的陽性抑制劑或受試藥。在各探針底物Km范圍內選擇孵育的濃度:非那西丁(10 μmol·L-1)、安非他酮(100 μmol·L-1)、紫杉醇(10 μmol·L-1)、甲苯磺丁脲(100 μmol·L-1)、奧美拉唑(20 μmol·L-1)、右美沙芬(5 μmol·L-1)和睪酮(55 μmol·L-1)。通過檢測特異性反應的底物代謝量，評價各個CYP同工酶的活性。

將緩沖溶液、人肝微粒體、探針底物和受試藥混勻，37℃水浴預孵5 min，加入NADPH(預孵5 min)啟動反應，37℃水浴孵育30 min后，冰上冷卻，并加入100 μL的預冷甲醇終止反應，渦旋，15 700×g，4℃離心10 min，取上清進樣分析，測定底物代謝量，計算相對酶活性。

1.3 底物的HPLC定量分析 本實驗室已經(jīng)建立HPLC方法定量檢測相應的7個探針底物。① 非那西丁、奧美拉唑、睪酮檢測條件如下：流動相為乙腈-水(45/55，V/V)；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為20 μL；柱溫為25℃；檢測波長為245 nm。② 安非他酮檢測條件如下：流動相為乙腈-磷酸氫二鉀(0.01 mol·L-1，pH為7.4)(60/40，V/V)；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為20 μL；柱溫為25℃；檢測波長為248 nm。③ 紫杉醇檢測條件如下：流動相為甲醇-水(60～70/25 min，V/V)；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為20 μL；柱溫為45℃；檢測波長為230 nm。④ 甲苯磺丁脲檢測條件如下：流動相為乙腈-磷酸二氫銨(0.01 mol·L-1，pH為3.5)(40/60，V/V)；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為20 μL；柱溫為25℃；檢測波長為254 nm。⑤ 右美沙芬檢測條件如下：流動相為乙腈-磷酸氫二鈉(0.01 mol·L-1，pH為3.0)(40/60，V/V)；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為100 μL；柱溫為25℃；檢測波長為278 nm。

2 結果

2.1 肝微粒體孵育體系的驗證 應用睪酮作為肝微粒體經(jīng)典底物進行代謝，驗證肝孵育體系。從肝微粒體檢測結果可知，睪酮在人微粒體體外孵育體系中代謝30 min后，代謝率達63.28%，睪酮代謝率穩(wěn)定(Tab 1)，微粒體體外孵育體系活性良好，可用于實驗研究。

Tab 1 Metabolism rate of testosterone

2.2 SM-1對人肝微粒體中的CYP同工酶抑制作用 在本研究中SM-1應用的抑制濃度(3 mg·L-1) ，SM-1對HLM中7種CYP同工酶代謝的抑制率見Tab 2。在檢測SM-1對人肝微粒體CYP經(jīng)典底物的抑制情況時，對CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的抑制率分別是0.05%、3.37%、0.08%、2.07%、4.20%、-0.15%、10.84%，提示SM-1對CYP3A4可能有抑制作用。

Tab 2 The inhibition rate of SM-1 on each subtype enzyme substrate

3 討論

本實驗在體外的人肝微粒體孵育體系中，探針底物選用了美國FDA推薦的種類和濃度，系統(tǒng)性評價了SM-1對于7種比較常見CYP同工酶的抑制作用，通過單點峰面積法定量地評價了SM-1對CYP酶的抑制活性。由于CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4 7種亞型酶介導了90%以上的臨床藥物生物轉化，是作為基于CYP酶藥物相互作用的研究重點[11]。因為CYP各個亞型同工酶會參與不同的代謝反應，因此，CYP酶介導的代謝和生成的代謝產物種類或量都存在著一些差異[12]。在本次實驗中，為了減少受試藥物和7種不同探針底物的相互干擾作用，采取了7種不同的色譜條件。CYP2D6和CYP3A4是具有重要意義的CYP450藥物代謝酶，參與了臨床上多種常用藥物的代謝。而SM-1可能會對CYP2D6和CYP3A4有抑制作用，因此在臨床上，SM-1和經(jīng)CYP2D6和CYP3A4代謝的底物合用時,應該注意避免藥物相互作用的發(fā)生,避免SM-1使這些底物的代謝減少，底物血藥濃度增加，增強藥物的毒副作用，甚至造成生命危險。

(致謝：本項工作主要在中南大學湘雅醫(yī)學院與湖南省泰格湘雅制藥共同完成，在此表示感謝。)

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Inhibitory effect of SM-1 on human liver microsomal cytochrome P450 enzyme

CHEN Yan-fen,CHEN Jing-xiu, SUN Meng, DING Jun-yao, CHENG Ze-neng, HU Gao-yun, DING Jin-song,ZHU Qu-bo
(SchoolofPharmaceuticalSciencesinCentralSouthUniversity,Changsha410013,China)

Aim To investigate the effect of SM-1 on seven main cytochrome P450(CYP450) in human liver microsomes.Methods Substrate or SM-1 was incubated with human liver microsomes for 30 mininvitro, and divided into control group and experimental group. The effects of SM-1 on the main phase I metabolic enzymes in human liver microsomes was detected by HPLC. Phenacetin, bupropion, paclitaxel, tolbutamide, omeprazole, dextromethorphan, testosterone were investigated as probe drugs.Results Inhibition rate of SM-1 on the classical substrate of human liver microsomal CYP was 0.05%,3.37%,0.08%,2.07%,4.20%,-0.15% and 10.84%, respectively.Conclusions SM-1 may have inhibitory effect on CYP3A4.Attention should be paid to the interaction of clinical drug induced by CYP enzyme inhibition.

SM-1;cytochrome P450；substrate；inhibition rate；microsomes；subtypes of enzymes

2016-12-02,

2017-01-04

國家科技部“重大新藥創(chuàng)新與發(fā)展”重大專項項目(No 2012ZX09103101-051)；基礎研究中國中央大學資助項目(No 7601110179)；中南大學研究生自主探索創(chuàng)新基金(No 2016zzts494)

陳燕芬(1991-)，女，碩士生，研究方向：臨床前藥動學，E-mail: 852605755@qq.com; 程澤能(1965-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：藥物代謝機制，通訊作者，E-mail: chengzn@csu.edu.cn; 朱曲波(1981-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：microRNA在癌癥中以及眼科疾病中的作用以及藥物胃腸道轉運，通訊作者，E-mail: biqbz@hotmail.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.016.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.008

A

1001-1978(2017)05-0627-03

R322.47；R345.99；R977.3；R979.1