韓 軍，程小龍，胡坤媚，徐杭杭，陳志武

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230031)

杜鵑花總黃酮對(duì)缺血/再灌注損傷模型大鼠腦基底動(dòng)脈TRPV4的作用研究

韓 軍1，程小龍1，胡坤媚1，徐杭杭1，陳志武2

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230031)

目的 探討杜鵑花總黃酮(TFR)對(duì)缺血/再灌注損傷模型大鼠腦基底動(dòng)脈(CBA)瞬時(shí)感受器電位通道香草酸受體亞型Ⅳ(TRPV4)的作用。方法 以改良四血管阻斷法(4-VO)建立大鼠缺血/再灌注模型(IR)；運(yùn)用加壓灌注法和細(xì)胞膜電位記錄法，離體觀察TFR對(duì)KCl預(yù)收縮IR大鼠CBA的舒張作用和超極化反應(yīng)及TRPV4阻斷劑釕紅(RR)對(duì)其的影響；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法，在體觀察TFR對(duì)IR大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)以及RR對(duì)其的影響。結(jié)果 遞增濃度的TFR可誘導(dǎo)IR大鼠離體CBA產(chǎn)生明顯劑量依賴性的舒張效應(yīng)和超極化反應(yīng)。去除血管內(nèi)皮細(xì)胞后，TFR仍能介導(dǎo)CBA產(chǎn)生較弱的舒張作用和超極化反應(yīng)，與血管內(nèi)皮完整組比較，差異有顯著性(P<0.01)；去除一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)舒張作用后，TFR仍能誘導(dǎo)IR大鼠CBA產(chǎn)生明顯的舒張效應(yīng)和超極化作用，此作用可被TRPV4通道阻斷劑RR抑制；TFR可明顯上調(diào)IR大鼠腦血管TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)，而阻斷TRPV4可明顯抑制TFR上調(diào)的TRPV4基因表達(dá)。結(jié)論 TFR能介導(dǎo)IR大鼠CBA產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)皮依賴性和較弱的內(nèi)皮非依賴性血管舒張反應(yīng)和超極化作用，其內(nèi)皮依賴性效應(yīng)推測(cè)可能與TFR促使腦血管內(nèi)皮激活，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生成和釋放內(nèi)皮衍生性超極化因子(EDHF)增多，繼而激活TRPV4，引發(fā)Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞膜超極化，產(chǎn)生血管舒張效應(yīng)有關(guān)。

杜鵑花總黃酮；缺血/再灌注損傷；腦基底動(dòng)脈；超極化作用；血管舒張效應(yīng)；內(nèi)皮衍生性超極化因子；瞬時(shí)感受器電位通道香草酸受體亞型Ⅳ

缺血性腦卒中是腦動(dòng)脈血栓形成或栓塞導(dǎo)致血流短暫或持續(xù)減少，引起的以腦組織缺血缺氧、萎縮壞死等腦部缺血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，是導(dǎo)致人類死亡的三大疾病之一。其病理分子機(jī)制尚不明了，臨床治療效果不理想，深入探索其病理機(jī)制，尋求抗缺血性腦卒中新藥是國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

在血管舒張反應(yīng)過(guò)程中，血管內(nèi)皮衍生性超極化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor，EDHF)是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)、前列環(huán)素(prostacycline，PGI2)之后，在內(nèi)皮釋放的第三類舒血管因子[1]。瞬時(shí)感受器電位通道香草酸受體亞型Ⅳ(transient receptor potential vanilloid receptor 4，TRPV4)存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞上，能被機(jī)體內(nèi)外環(huán)境多種理化刺激所激活，激活后可促使Ca2+內(nèi)流，對(duì)機(jī)體完成多種生理功能和疾病病理發(fā)展具有重要意義[2]。

杜鵑花總黃酮(total flavones of rhododendra, TFR)是從杜鵑花中提取的黃酮類物質(zhì)，包含金絲桃苷、蘆丁、映山紅素及槲皮素等主要成分[3]。研究已證實(shí)TFR具有減輕腦水腫，降低腦梗死面積，減少缺氧復(fù)氧損傷神經(jīng)元內(nèi)Ca2+，保護(hù)神經(jīng)元等抗腦缺血損傷作用[4]。但TFR能否介導(dǎo)缺血性腦損傷大鼠腦基底動(dòng)脈(cerebral basilar artery, CBA)產(chǎn)生EDHF效應(yīng)及TRPV4對(duì)其作用的影響，鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以全腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, IR)大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討IR 對(duì)CBA血管內(nèi)皮TRPV4功能的影響及TFR誘導(dǎo)CBA產(chǎn)生舒張效應(yīng)與TRPV4的關(guān)系，以期探尋缺血性腦卒中發(fā)病的細(xì)胞分子機(jī)制和防治新策略。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SD大鼠，♂，體質(zhì)量220～260 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供[批號(hào)：SCXK(滬)2013-0006]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度55%～60%，自然光照，動(dòng)物自由飲水與進(jìn)食。

1.2 藥品與試劑 TFR(總黃酮含量≥85%)，安徽省合肥市合源醫(yī)藥科技有限公司；左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME)(批號(hào)：S0006)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010S)、內(nèi)參GAPDH抗體(批號(hào)：AG019)、二抗(兔IgG、鼠IgG)，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；吲哚美辛(indomethacin，Indo)(批號(hào)：N5751)、TRPV4阻斷劑釕紅(ruthenium red，RR，批號(hào)：R2751)及TRPV4抗體(批號(hào)：SAB2104243)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品； RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：RR037A)及SYBR-Green熒光定量試劑盒(批號(hào)：RR420A)，日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 多通道快速微量加藥系統(tǒng)(MPS-2型)，華中科大儀博生命科學(xué)儀器有限公司；奧林巴斯顯微鏡，日本OLYMPUS公司；MO-81微電極推進(jìn)器，日本 Narishige公司；玻璃電極拉制儀，美國(guó)MDI公司；Intra 767 微電極放大器，美國(guó)WPI 公司；Model 550 酶標(biāo)儀、Mini PROTEAN電泳系統(tǒng)及Mini PROTEAN轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；逆轉(zhuǎn)錄PCR儀及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。

2 方法

2.1 改良四血管阻斷法(four-vessel occlusion，4-VO)建立大鼠IR模型[5]10%水合氯醛(330 mg·kg-1)注射麻醉大鼠，分離出兩側(cè)頸總動(dòng)脈，放置絲線備用。頸背部皮膚切開(kāi)暴露出第一頸椎雙側(cè)翼小孔，用電凝針(直徑0.5 mm)電凝兩側(cè)椎動(dòng)脈使其永久閉合，縫合切口，待動(dòng)物清醒回籠飼養(yǎng)。術(shù)后24 h，夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈25 min，造成全腦缺血。之后再同時(shí)松開(kāi)雙側(cè)動(dòng)脈夾，使腦血流再灌注2 h。模型建立成功標(biāo)志為大鼠翻正反射消失，自主呼吸存在，瞳孔變灰白及腦電波變低平。術(shù)中及術(shù)后保持肛溫37 ℃。假手術(shù)組不夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，不電凝兩側(cè)椎動(dòng)脈。

2.2 加壓灌注法測(cè)定離體腦血管舒縮功能 大鼠快速斷頭取腦，在冰浴生理鹽溶液中分離出CBA，制成血管環(huán)片段放置灌流浴槽中，將微玻璃管套入血管環(huán)兩端，用手術(shù)線將其固定。接著用生理鹽溶液(含95% O2+5% CO2混合氣體，37 ℃，pH 7.4)加壓灌注(灌注壓11.305 kPa，流量150 μL·min-1)CBA血管內(nèi)腔與浴槽中的血管腔外側(cè)。在體視顯微鏡下，觀察與記錄CBA直徑的大小，以血管直徑的變化反映CBA舒縮功能的變化。血管舒張率/%=(Dx-Dmin)/(Dmax-Dmin)×100%。Dx為加入各受試藥物后的直徑；Dmin為加入收縮劑后收縮穩(wěn)定時(shí)的直徑；Dmax為血管平衡1 h 時(shí)的直徑。

通過(guò)機(jī)械法，用一根細(xì)頭發(fā)絲在CBA血管腔內(nèi)來(lái)回摩擦去除IR大鼠CBA內(nèi)皮細(xì)胞[3]。

2.3 細(xì)胞膜電位記錄法測(cè)定血管平滑肌細(xì)胞靜息膜電位[5]大鼠快速斷頭取腦取出CBA，在倒置顯微鏡下將血管段縱向剖開(kāi)固定在灌流槽中，血管內(nèi)面向上，持續(xù)灌流生理鹽溶液(含95% O2+5% CO2混合氣體，37 ℃)，溫育1 h后，再往灌流液中加入相應(yīng)的溶媒或藥物溫育0.5 h。在體視顯微鏡下，用微操縱器將玻璃微電極(電阻30～50 MΩ，3 mol·L-1KCl)推至血管表面，并穿刺細(xì)胞。細(xì)胞電信號(hào)經(jīng)微電極放大器放大后，輸入至Powerlab/4sp 型計(jì)算機(jī)信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄血管平滑肌細(xì)胞的靜息膜電位。如果靜息膜電位負(fù)值進(jìn)一步加大，則表示出現(xiàn)平滑肌細(xì)胞膜電位的超極化現(xiàn)象。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞TRPV4 mRNA的表達(dá) ♂大鼠40只，隨機(jī)分為5組：Sham組、IR組、TFR用藥組(100 mg·kg-1)、100 mg·kg-1TFR + 2 mg·kg-1TRPV4通道阻斷劑RR組、RR組(2 mg·kg-1)。各組于缺血前20 min尾靜脈注射相應(yīng)受試藥物。嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒提取各組大鼠腦血管總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃ 2 h)。其PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性30 s，95℃退火5 s，60℃延伸31 s，反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)行溶解曲線程序，分析產(chǎn)物特異性。用7300 System SDS Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)各組2-△△Ct值，計(jì)算相應(yīng)RQ值，比較各組mRNA的表達(dá)水平。所用引物見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

2.5 Western blot 法檢測(cè)大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞TRPV4蛋白的表達(dá) ♂大鼠35只，分組同“2.4”。各組于缺血前20 min尾靜脈注射相應(yīng)受試藥物。低溫提取腦基底動(dòng)脈蛋白。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每孔上樣40 μg蛋白，運(yùn)用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入GADPH (1 ∶1 000)及TRPV4 (1 ∶1 000)一抗孵育過(guò)夜(4 ℃)，再加入相應(yīng)二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液顯色、曝光，成像結(jié)果采用Image J 1.43分析軟件測(cè)定集成光密度值。

3 結(jié)果

3.1 TFR誘導(dǎo)的IR大鼠CBA血管舒張效應(yīng)和超極化反應(yīng)及去除血管內(nèi)皮對(duì)其作用的影響 如Fig 1所示，用30 mmol·L-1KCl預(yù)收縮IR大鼠離體CBA后，加入遞增濃度TFR(11～2 700 mg·L-1)可誘導(dǎo)血管產(chǎn)生劑量依賴性的舒張反應(yīng)和超極化效應(yīng)，與溶媒組比較差異有顯著性(P<0.01)。去除CBA內(nèi)皮后，TFR仍能介導(dǎo)IR大鼠CBA產(chǎn)生舒張作用與超極化效應(yīng)，其最大舒張率為(29.71±3.18)%，最大超極化幅度為(-4.49±1.98)mV(P<0.01vsVehicle)。但與血管內(nèi)皮完整組相比較，其效應(yīng)明顯減弱(P<0.01)。提示，血管內(nèi)皮依賴性機(jī)制和較弱的血管內(nèi)皮非依賴性機(jī)制兩者均參與TFR對(duì)IR大鼠CBA舒張與超極化效應(yīng)。

A: The dilatation of TFR in the 30 mmol·L-1KCl-preconstricted cerebral basilar arteries of -Endo and+Endo in ischemia/reperfusion injury in rats; B: The TFR-induced hyperpolorization in VSMC from cerebral basilar arteries of -Endo and +Endo in ischemia reperfusion injury in rats. -Endo: endotheliumdenudated and +Endo: endothelium-intact.**P<0.01vsVehicle(+Endo);##P<0.01vsIR (+Endo)

3.2 TFR誘導(dǎo)IR大鼠CBA產(chǎn)生的非PGI2非NO舒張反應(yīng)和超極化作用 在大鼠CBA中灌注Indo(10 μmol·L-1)與L-NAME(30 μmol·L-1)去除PGI2、NO舒張作用，預(yù)處理30 min，當(dāng)血管穩(wěn)定時(shí)加入KCl(30 mmol·L-1)，待血管收縮平衡分別加入11～2 700 mg·L-1TFR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者介導(dǎo)大鼠CBA的舒張效應(yīng)和超極化反應(yīng)明顯減弱，Sham組血管最大舒張率降至(45.03±3.05)%，最大超極化幅度絕對(duì)值降至(-8.34±1.06)mV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；IR組血管最大舒張率降至(64.30±4.21)%，最大超極化幅度絕對(duì)值降至(-11.41±2.05)mV，差異有顯著性(P<0.01)。提示PGI2與NO參與誘導(dǎo)Sham組與IR組大鼠CBA的舒張作用和超極化反應(yīng)。在去除PGI2和NO舒張效應(yīng)后，IR組大鼠CBA的最大舒張率和最大超極化幅度絕對(duì)值均明顯大于Sham組(P<0.01)。提示當(dāng)IR發(fā)生時(shí)，TFR介導(dǎo)的大鼠CBA非PGI2非NO舒張效應(yīng)和超極化反應(yīng)是上調(diào)的。見(jiàn)Fig 2。

3.3 TRPV4阻斷劑對(duì)TFR介導(dǎo)IR大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生非NO非PGI2樣舒張效應(yīng)和超極化作用的影響 如Fig 3所示，IR大鼠CBA經(jīng)過(guò)10 μmol·L-1Indo、30 μmol·L-1L-NAME及10 μmol·L-1TRPV4阻斷劑RR預(yù)處理30 min后，TFR對(duì)IR大鼠CBA的舒張作用和超極化效應(yīng)明顯被阻滯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示TRPV4阻斷劑RR可以有效抑制TFR誘導(dǎo)的非PGI2非NO樣舒張效應(yīng)和超極化作用。

3.4 TFR對(duì)IR大鼠腦血管TRPV4 mRNA表達(dá)及TRPV4阻斷劑對(duì)其的影響 與Sham組相比，IR組大鼠CBA中TRPV4 mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與IR組比較，單用TFR組及合用TRPV4阻斷劑RR組大鼠腦血管TRPV4 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，單用RR組明顯減少(P<0.01)；合用RR組大鼠腦血管TRPV4 mRNA表達(dá)明顯低于單用TFR組(P<0.01)，高于單用RR組(P<0.01)。提示TFR能上調(diào)IR大鼠腦血管TRPV4 mRNA表達(dá)，但RR可抑制TFR誘導(dǎo)的腦血管TRPV4 mRNA表達(dá)的上調(diào)。見(jiàn)Fig 4。

3.5 TFR對(duì)IR大鼠腦血管TRPV4蛋白表達(dá)及TRPV4阻斷劑對(duì)其的影響 如Fig 5所示，與Sham組相比，IR組大鼠TRPV4蛋白表達(dá)含量明顯降低(P<0.01)；當(dāng)給予TFR和TRPV4阻斷劑后，與IR組相比，單用TFR組及合用TRPV4阻斷劑RR組CBA中TRPV4蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，單用RR組明顯減少(P<0.01)；合用RR組大鼠TRPV4蛋白表達(dá)含量明顯低于單用TFR組(P<0.01)，高于單用RR組(P<0.01)。提示TFR在一定程度上能夠上調(diào)IR大鼠腦血管TRPV4蛋白的表達(dá)，但TRPV4阻斷劑RR可明顯抑制TFR誘導(dǎo)的腦血管TRPV4蛋白表達(dá)的上調(diào)。

Fig 2 Effect of co-application of Indo (10 μmol·L-1) and L-NAME (30 μmol·L-1) on TFR-induced relaxation (A)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsIR;▲▲P<0.01vsSham(+L-NAME+Indo)

**P<0.01vsvehicle;##P<0.01vsIR(L-NAME+Indo)

**P<0.01vssham；##P<0.01vsIR；▲▲P<0.01vsTFR;△△P<0.01vsRR

4 討論

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類生命健康的難治性疾病之一，約75%幸存者遺留有失語(yǔ)、癱瘓等嚴(yán)重殘疾，在全球已成為第一致殘和第二致死的原因[6]。腦卒中分為缺血性腦卒中與出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占腦卒中80%。急性或慢性長(zhǎng)期腦缺血會(huì)造成腦組織和細(xì)胞功能嚴(yán)重受損。臨床上缺血性腦卒中多發(fā)生在CBA等腦主要?jiǎng)用}處，當(dāng)其發(fā)生痙攣，可使血管腔狹窄、內(nèi)徑縮小，導(dǎo)致腦血流量急劇減少，從而引起腦供血嚴(yán)重不足。調(diào)查研究顯示，近年來(lái)腦卒中發(fā)病率呈年輕化、上升趨勢(shì)。目前病理機(jī)制不清，尚無(wú)療效確切的治療藥物。

Fig 5 Effect of TFR and RR on TRPV4 protein expression level of cerebral basilar arteries in ischemia/reperfusion

**P<0.01vssham；##P<0.01vsIR；▲▲P<0.01vsTFR;△△P<0.01vsRR

研究表明[3]，腦血管收縮與舒張因子導(dǎo)致的血管張力變化在缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中是一個(gè)決定性因素。在腦血管舒張因子中，作為非PGI2非NO舒血管物質(zhì)EDHF在機(jī)體生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其在病理情況下如腦外傷等，其作用更加突出，它在調(diào)節(jié)腦血流量方面至關(guān)重要[7]。目前，對(duì)EDHF調(diào)控血管功能的研究主要采用聯(lián)用環(huán)加氧酶阻斷劑與一氧化氮合成酶阻斷劑排除PGI2、NO作用后，觀察EDHF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞超極化與舒張效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中，課題組發(fā)現(xiàn)遞增濃度的TFR可介導(dǎo)預(yù)收縮IR大鼠離體CBA產(chǎn)生劑量依賴性的舒張作用和超極化效應(yīng)。去除CBA內(nèi)皮后，TFR誘導(dǎo)的上述效應(yīng)明顯減弱。結(jié)果提示，TFR介導(dǎo)IR大鼠CBA產(chǎn)生的舒張與超極化效應(yīng)主要是血管內(nèi)皮依賴性的。當(dāng)運(yùn)用環(huán)加氧酶抑制劑Indo和一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME去除PGI2、NO 血管舒張作用后，TFR仍能誘導(dǎo)IR組和Sham組大鼠CBA產(chǎn)生明顯的血管內(nèi)皮依賴性舒張與超極化作用，且IR組血管最大舒張率和最大超極化幅度絕對(duì)值明顯大于Sham組。結(jié)果提示，當(dāng)IR發(fā)生時(shí)，TFR介導(dǎo)大鼠CBA產(chǎn)生的非PGI2非NO舒張效應(yīng)和超極化反應(yīng)是上調(diào)的。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果[8]，我們推測(cè)TFR介導(dǎo)IR大鼠CBA產(chǎn)生的非PGI2非NO血管舒張作用應(yīng)為EDHF效應(yīng)。

瞬時(shí)受體電位通道(TRP)是細(xì)胞膜上一類重要的陽(yáng)離子通道家族，其通道蛋白分布十分廣泛。TRPV是TRP家族中的一個(gè)亞家族，功能上屬于Ca2+通道蛋白[9]。哺乳動(dòng)物TRPV亞家族共有6個(gè)成員，分別為TRPV1至TRPV6，廣泛分布在大腦、心臟、肝、腎、脾等組織中，在機(jī)體多種重要的生理功能與病理變化中發(fā)揮著重要作用[10]。TRPV4由 871 個(gè)氨基酸組成，可能包括33 個(gè)氨基酸基序列和6個(gè)錨定蛋白，在動(dòng)脈上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞等均有廣泛表達(dá)。TRPV4可感受機(jī)體環(huán)境壓力改變促使通道開(kāi)放，引起Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，觸發(fā)Ca2+依賴的一系列生理反應(yīng)，包括乙酰膽堿、谷氨酸等介質(zhì)的釋放[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)脈血管對(duì)血流剪應(yīng)力的反應(yīng)關(guān)鍵取決于血管內(nèi)皮TRPV4的激活，后者被認(rèn)為可能是治療腦血管疾病的新靶點(diǎn)之一[12]。釕紅(RR)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)對(duì)TRPV4具有非特異性阻斷作用的拮抗劑，可完全阻滯大鼠、小鼠及人的TRPV4通道[13]。實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)給予TRPV4阻斷劑RR后，TFR介導(dǎo)的IR組大鼠腦血管EDHF舒張作用和超極化反應(yīng)被阻滯。提示阻斷TRPV4可明顯抑制TFR介導(dǎo)腦血管產(chǎn)生的EDHF效應(yīng)。其結(jié)果與Zhang等[14]報(bào)道在TRPV4基因敲除小鼠，ACh誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管舒張效應(yīng)中NO和EDHF作用是減弱的一致。研究已證實(shí)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞上只有TRPV4呈高水平表達(dá)[15]。課題組對(duì)IR組大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上TRPV4基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，IR組大鼠CBA內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少。而用藥后，TFR可明顯增加IR組大鼠CBA內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)，且該作用可被TRPV4阻斷劑RR明顯抑制。提示當(dāng)腦缺血/再灌注損傷時(shí)，大鼠CBA內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4 mRNA和蛋白表達(dá)是下調(diào)的，而TFR可通過(guò)激活TRPV4，上調(diào)IR組大鼠CBA內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4 基因表達(dá)。

綜上所述，課題組推測(cè)，腦缺血/再灌注損傷時(shí)，腦基底動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上TRPV4活性與功能是降低的，而TFR可能通過(guò)作用于腦基底動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)源性舒血管物質(zhì)EDHF生成增多，激活血管壁上的TRPV4，促使Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，繼發(fā)細(xì)胞膜超極化，繼而關(guān)閉細(xì)胞膜上電壓依賴性Ca2+通道，阻滯Ca2+內(nèi)流發(fā)揮舒血管作用，從而產(chǎn)生改善缺血性腦卒中損傷的保護(hù)作用。其進(jìn)一步機(jī)制還有待深入研究。

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Effects of total flavones of rhododendra on transient receptor potential vanilloid receptor 4 in cerebral basilar arteries of rats subjected to ischemia/reperfusion injury

HAN Jun1，CHENG Xiao-long1，HU Kun-mei1，XU Hang-hang1，CHEN Zhi-wu2
(1.DeptofPharmacology，SchoolofBasicMedicine，Third-GradePharmacologyLaboratoryofState，AdministrationofTraditionalChineseMedicine,WannanMedicalCollege，WuhuAnhui241002,China; 2.DeptofPharmacology，SchoolofBasicMedicine，AnhuiMedicalUniversity，Hefei230031，China)

Aim To research the effects of total flavones of rhododendra (TFR) on transient receptor potential vanilloid receptor 4 (TRPV4) in cerebral basilar arteries (CBA) of rats subjected to ischemia/reperfusion (IR)injury. Methods The model of total brain IR was established by four-artery occlusion (4-VO) method in rats. Arterial pressure perfusion and cell membrane potential recording methods were used for surveying the dilatation and hyperpolarization of TFR and ruthenium red(RR, an inhibitor of TRPV4) in the KCl-preconstricted CBAexvivoin rats subjected to IR. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot were utilized to investigate the TRPV4 mRNA and protein expressions of TFR and RR in cerebrovascular endothelial cells of CBAinvivoin rats subjected to IR. Results 11～2 700 mg·L-1TFR significantly induced concentration-dependent hyperpolarization and dilatation in the KCl-preconstricted CBA in rats subjected to IR. TFR still produced degenerative hyperpolarization and dilatation by removal of endothelium in CBA, which was remarkably attenuated as compared with endothelium-intact group (P<0.01). After removal of NO and PGI2vasodilatation, TFR obviously elicited the hyperpolarization and dilatation that were further decreased by RR (an inhibitor of TRPV4) in IR CBAs. TFR pretreatment apparently increased the level of TRPV4 mRNA and protein expressions in IR CBAs. These effects were restrained by RR, an inhibitor of TRPV4. Conclusions TFR could mediate endothelium-dependent and endothelium-independent effects. The endothelium-derived dilatation may be related to the increase of endothelium activity and endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) generation and release that have been promoted by TFR, and secondarily activating TRPV4, which results in Ca2+inflow and subsequent hyperpolarization of vascular smooth muscle cell membrane and vasorelaxation.

TFR; ischemia/reperfusion injury；cerebral basilar artery; hyperpolarization; vasodilatation; endothelium-derived hyperpolarizing factor; TRPV4

2016-12-15,

2017-01-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81173596)；安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No KJ2015A157)

韓 軍(1975-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，E-mail: aku110@163.com

時(shí)間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.038.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.019

A

1001-1978(2017)05-0685-07

R-332；R284.1；R322.121；R331.32；R392.11；R743.302.2