蘇曉晴，張李琦，鄭明學(xué)，戴浩楠，史晨婕，白瑞，席柔，貢鑫，張黎，徐之勇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

紫外分光光度法測(cè)定恩諾沙星微囊含量方法的建立

蘇曉晴，張李琦，鄭明學(xué)*，戴浩楠，史晨婕，白瑞，席柔，貢鑫，張黎，徐之勇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]為了建立一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可行的恩諾沙星明膠微囊的含量測(cè)定方法，試驗(yàn)選用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定。[方法]通過(guò)專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn)等方法學(xué)研究，建立紫外分光光度法測(cè)定恩諾沙星明膠微囊含量的方法。[結(jié)果]恩諾沙星對(duì)照品溶液在2～16 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.103 0C-0.028 0(r=0.998 8)；精密度RSD為0.00%、0.14%、0.11%(n=3)；平均回收率為101.53%、98.03%、98.07%(n=3)，RSD為0.25%、0.05%、0.00%(n=3)。[結(jié)論]該方法的專屬性好，線性、回收率和精密度均符合要求，可以用作對(duì)恩諾沙星明膠微囊進(jìn)行質(zhì)量控制的測(cè)定方法。

恩諾沙星； 明膠微囊； 紫外分光光度法

恩諾沙星(Enrofloxacin)是上世紀(jì)80年代德國(guó)拜耳公司首先研制成功的動(dòng)物專用藥，是化學(xué)合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物。恩諾沙星具有廣譜抗菌、殺菌活性強(qiáng)、滲透性強(qiáng)、體內(nèi)分布廣泛，與其他抗菌藥無(wú)交叉耐藥性等特點(diǎn)。該藥適用于牛、豬、禽、犬、貓和水生動(dòng)物的敏感細(xì)菌及支原體所致的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及皮膚軟組織的各種感染[1]。恩諾沙星制劑在獸醫(yī)臨床上已得到廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)中已將其制成多種劑型，如片劑、粉劑、注射劑、普通顆粒劑等，但恩諾沙星本身具有強(qiáng)烈苦味和異味而影響適口性，甚至引起豬拒食，將藥物進(jìn)行包被可以改善其苦味?，F(xiàn)已研發(fā)出的新劑型有納米粒[2,3]、微球[4]、β-環(huán)糊精包合物[5]、 緩釋顆粒劑[6]等，但這些制劑還存在包被不完全、粒徑大、緩釋效果不明顯等缺點(diǎn)。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)以明膠為囊材，恩諾沙星為芯材，戊二醛為固化劑，采用單凝聚法制得恩諾沙星明膠緩釋微囊。

依據(jù)《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，須對(duì)制劑進(jìn)行質(zhì)量研究，含量測(cè)定為質(zhì)量研究中重點(diǎn)內(nèi)容之一，所以建立含量測(cè)定的方法非常重要。經(jīng)過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，未見報(bào)道恩諾沙星明膠微囊含量測(cè)定的具體方法?！吨袊?guó)獸藥典》[7]2010版中規(guī)定的恩諾沙星含量測(cè)定方法為高效液相色譜法；《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[8]2003年版中恩諾沙星可溶性粉的含量測(cè)定方法為紫外分光光度法。高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、檢測(cè)限低、精確度高，但該方法成本昂貴、操作繁瑣、不適于快速分析和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；紫外分光光度法成本較低、操作快速簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，適于臨床應(yīng)用中對(duì)藥物的快速檢驗(yàn)。所以筆者采用紫外分光光度法對(duì)恩諾沙星明膠微囊含量進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)《獸用化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》對(duì)此方法的專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度等進(jìn)行驗(yàn)證，從而對(duì)分析方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可行性進(jìn)行考察，分析該方法是否符合測(cè)試項(xiàng)目的目的和要求，最終建立單凝聚法恩諾沙星明膠微囊的含量測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

恩諾沙星原料藥(含量99%)，購(gòu)自浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司；恩諾沙星對(duì)照品(含量99.8%)、胰酶，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；恩諾沙星明膠微囊，實(shí)驗(yàn)室自制；空白明膠微囊，實(shí)驗(yàn)室自制；氫氧化鈉，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鉀，購(gòu)自中國(guó)上海華星化工廠；磷酸二氫鉀，購(gòu)自北京精求化工有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器

電子分析天平，購(gòu)自?shī)W豪斯儀器有限公司；超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；恒溫玻璃水浴鍋，購(gòu)自金壇市杰瑞爾電器有限公司；紫外可見光分光光度計(jì)，購(gòu)自上海元析儀器有限公司。

1.3 試劑的配制

1.3.1 胰酶液的配制

磷酸二氫鉀0.41 g，磷酸氫二鉀5.59 g，胰酶10 g，去離子水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至8.0，配制后，37 ℃、100 r·min-1條件下振蕩2 h，使胰酶游離出來(lái)，過(guò)濾，取濾液待用[9]。

1.3.2 恩諾沙星對(duì)照品母液的配制

精確稱取實(shí)際含量為10 mg 的恩諾沙星對(duì)照品，置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液定容至刻度，制成100 mg·L-1的恩諾沙星對(duì)照品母液，4 ℃保存，備用。

1.3.3 恩諾沙星對(duì)照品系列濃度的配制

精密吸取對(duì)照品母液1、2、3、4、5、6、7、8 mL置于50 mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液稀釋至刻度搖勻，制得2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mg·L-1系列濃度的恩諾沙星對(duì)照品溶液。

1.3.4 恩諾沙星明膠微囊及空白明膠微囊母液的配制

精密稱取恩諾沙星明膠微囊0.1 g，置于100 mL燒杯中，加50 mL胰酶液，放于45 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)，期間每隔半小時(shí)振搖一次，于2.5 h時(shí)超聲半小時(shí)取出，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液定容至100 mL容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，過(guò)濾即得1 g·L-1的恩諾沙星明膠微囊母液。

精密稱取空白明膠微囊0.1 g，配制成1 g·L-1的空白明膠微囊母液，配制方法同上。

1.3.5 恩諾沙星明膠微囊及空白明膠微囊系列濃度配制

分別取恩諾沙星明膠微囊母液1、2、3、4、5、6 mL于6個(gè)100 mL容量瓶中，用氫氧化鈉定容至刻度，制得10、20、30、40、50、60 mg·L-1的恩諾沙星微囊溶液。

分別取空白明膠微囊母液2、3 mL于100 mL容量瓶中，用氫氧化鈉定容至刻度，制得20、30 mg·L-1空白明膠微囊溶液。

1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取恩諾沙星對(duì)照品溶液及恩諾沙星明膠微囊溶液，利用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，根據(jù)紫外吸收?qǐng)D譜確定恩諾沙星最大吸收波長(zhǎng)。

1.5 專屬性試驗(yàn)

取恩諾沙星明膠微囊溶液及空白明膠微囊溶液，依照紫外分光光度法，分別以空囊液和胰酶液為參比校準(zhǔn)基線，將上述溶液分別在波長(zhǎng)200～400 nm處進(jìn)行掃描，記錄紫外吸收譜圖以確定恩諾沙星明膠微囊與恩諾沙星對(duì)照品的最大吸收是否相同以及輔料(空白明膠微囊)在最大吸收波長(zhǎng)處有無(wú)吸收。

1.6 恩諾沙星明膠微囊溶解時(shí)間的測(cè)定

精確稱取3份同批次恩諾沙星明膠微囊0.1 g，分別置于3個(gè)100 mL燒杯中，加50 mL胰酶液，放于45 ℃超聲波清洗器內(nèi)24 h，期間每隔半小時(shí)振搖一次，從1 h開始，每小時(shí)取樣一次，每次取樣1 mL，取樣前超聲半小時(shí)，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液定容至100 mL容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，過(guò)濾即得20 mg·L-1的恩諾沙星明膠微囊溶液，以空囊液為參比，在確定的最大波長(zhǎng)處測(cè)定以上各濃度恩諾沙星明膠微囊溶液的吸光度值(OD值)，測(cè)定不同時(shí)間微囊溶解度的變化。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 mg·L-1系列濃度的恩諾沙星對(duì)照品溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD值，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性圖。

1.8 精密度試驗(yàn)

取同一批號(hào)的恩諾沙星明膠微囊制成20、30、40 mg·L-13種不同濃度供試品溶液，以空囊液為參比，分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處吸光度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，記錄并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值(X)×100%。

1.9 回收率試驗(yàn)

取3份30 mg·L-1恩諾沙星明膠微囊溶液于三個(gè)燒杯中，每份10 mL，分別添加10 mL濃度為10.0、20.0、30.0 mg·L-1的恩諾沙星對(duì)照品溶液，最終制備成5.0、10.0、15.0 mg·L-1三個(gè)濃度的供試液，分別測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)處的OD值。每個(gè)濃度重復(fù)3次。計(jì)算3個(gè)不同添加濃度的回收率、平均回收率、RSD，加樣回收率/%=加樣后測(cè)定值/加入對(duì)照品含量×100%。各濃度下平均回收率應(yīng)在98.0%～102.0% 之間，9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的RSD應(yīng)不大于2.0%[10]。

1.10 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中的組間數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差差異顯著性分析，試驗(yàn)結(jié)果中的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

恩諾沙星對(duì)照品及恩諾沙星明膠微囊紫外吸收?qǐng)D譜見圖1、圖2，由圖可知恩諾沙星對(duì)照品溶液最大吸收波長(zhǎng)為270 nm，恩諾沙星明膠微囊溶液的吸收波長(zhǎng)也為270 nm，所以試驗(yàn)選用270 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 恩諾沙星對(duì)照品紫外吸收?qǐng)D譜 Fig.1 Enrofloxacin UV absorption

圖2 恩諾沙星明膠微囊紫外吸收?qǐng)D譜Fig.2 Enrofloxacin microcapsule UV absorption

2.2 專屬性試驗(yàn)

由輔料紫外吸收?qǐng)D譜(見圖3)可得輔料在270 nm處幾乎無(wú)吸收，不干擾恩諾沙星的測(cè)定。

圖3 空白輔料紫外吸收?qǐng)D譜Fig.3 Accessories UV absorption

2.3 恩諾沙星明膠微囊溶解時(shí)間的測(cè)定

恩諾沙星微囊溶解3、4、6、8、10 h，溶液中恩諾沙星含量均顯著高于1h和2h，而3～10 h時(shí)，溶液中藥物含量無(wú)顯著差異(見表1)，說(shuō)明恩諾沙星微囊在胰酶液中3h即溶解完全。

表1 不同溶解時(shí)間恩諾沙星微囊溶液的吸光度

Table 1 The Absorbance of Enrofloxacin Microcapsule solution with different dissolution Time

時(shí)間/hTime吸光度平均值A(chǔ)verageabsorbancevalue恩諾沙星含量/mg·L-1Enrofloxacincontent10216a±00232375a±002320235b±00122559b±001230257c±00592779c±005940258c±00542785c±005460253c±00342740c±003480254c±00452743c±0045100249c±00152698c±0015

注：同一列數(shù)字字母不同，表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.05 level in the same row

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo)，通過(guò)線性回歸求得測(cè)定恩諾沙星對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.103 0C-0.028 0(r=0.998 7)，試驗(yàn)表明恩諾沙星在 2.0～16.0 mg·L-1檢測(cè)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖4。

圖4 恩諾沙星對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Enrofloxacin standard curve

2.5 精密度試驗(yàn)

精密度三個(gè)不同濃度下的RSD為0.00%、0.14%、0.11%，表明該方法的精密度高，詳見表2。

2.6 回收率試驗(yàn)

三個(gè)濃度下平均回收率分別為101.53%、98.03%、98.07%，RSD為0.25%、0.05%、0.00%，符合要求，說(shuō)明此方法準(zhǔn)確度良好，詳見表3。

表2 不同濃度恩諾沙星微囊溶液吸光度

Table 2 The Absorbance of Enrofloxacin Microcapsule solution with different density

恩諾沙星明膠微囊濃度/mg·L-1Concentrationofenrofloxacingelatinmicrocapsules平均OD值A(chǔ)verageabsorbanceRSD/%2002690±000000003004013±000060144005387±00006011

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

測(cè)定藥物含量時(shí)須先對(duì)微囊制劑中的藥物進(jìn)行提取，需先將明膠基質(zhì)水解，使藥物游離出來(lái)。經(jīng)查閱《中國(guó)獸藥典》及農(nóng)業(yè)部制定的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則，均未見微囊含量測(cè)定時(shí)提取藥物的方法。微球中藥物含量測(cè)定一般有幾種常用的方法：酶解法、微球溶解法(溶劑提取法)、超聲處理、研磨提取法等。明膠微球常用酶解法，即用酶(胃酶、胰酶)將載體材料的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞后使藥物完全釋放出來(lái)，然后再進(jìn)行測(cè)定[11]。趙世華[12]等人在測(cè)定單凝聚法制備的阿維菌素明膠微囊的載藥量時(shí)，先用1%的胰蛋白酶溶液，在37 ℃消化24 h，之后轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑中提取藥物，方法簡(jiǎn)單易行且準(zhǔn)確度好；張莎[13]等人進(jìn)行了緩釋型藥物載體明膠微球的制備及降解性能研究，試驗(yàn)比較了加入1%的胰蛋白酶與不加入胰酶的人工腸液(pH7.6)的降解能力，結(jié)果表明加入胰酶的人工腸液降解能力明顯優(yōu)于后者，且通過(guò)比較加了酶的人工腸液和人工胃液的降解能力，表明人工腸液(pH7.6)降解能力優(yōu)于人工胃液(pH1.3)；葛慶華[9]等人研究采用胰酶-超聲聯(lián)用法可使微球基質(zhì)全部降解，藥物又不被破壞。他曾用胰酶法和胰酶-超聲法在水解不同時(shí)間后測(cè)定甲氨蝶呤明膠微囊的相對(duì)含量，可見胰酶法在水解3、6、24 h后的測(cè)定值呈上升趨勢(shì)，而后者在上述各時(shí)間測(cè)得的含量基本不變，說(shuō)明此方法可靠準(zhǔn)確。由于胰酶體外酶解反應(yīng)的最適pH為8.0～9.0，溫度為40～50 ℃，所以葛慶華將胰酶液pH調(diào)為8.0，胰酶液濃度為0.5%，在水解微囊時(shí)，于(48±2) ℃恒溫水浴3 h，每30 min超聲震蕩一次，取樣前再超聲震蕩15 min。為此，本試驗(yàn)以葛慶華的胰酶-超聲聯(lián)用法水解明膠微囊，并將其中胰酶濃度修改為1%，測(cè)定其1、2、3、4、6、8、10 h對(duì)藥物水解情況，結(jié)果表明1～3 h時(shí)溶液中藥物含量逐漸升高，而3～10 h測(cè)得的溶液中藥物含量差異不顯著，說(shuō)明使用胰酶-超聲聯(lián)用法溶解微囊3 h即將藥物釋放完全。

本試驗(yàn)結(jié)果表明紫外分光光度法在測(cè)定恩諾沙星明膠緩釋微囊含量時(shí)，專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度均符合要求。《中國(guó)獸藥典》[7]2010版中規(guī)定的恩諾沙星含量測(cè)定方法為高效液相色譜法，徐長(zhǎng)舉[14]等人曾采用紫外分光光度法和 HPLC 法測(cè)定了恩諾沙星原料藥含量，且對(duì)兩種方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，紫外分光光度法測(cè)定恩諾沙星原料藥含量時(shí)線性關(guān)系良好、精密度、回收率均符合要求，穩(wěn)定性試驗(yàn)的OD值在9 h內(nèi)無(wú)顯著變化，與利用 HPLC 法的測(cè)定結(jié)果相比差異不顯著(P>0.05)，而在臨床應(yīng)用中紫外分光光度法更加的簡(jiǎn)便、快速。李銳[6]等人建立了恩諾沙星肺靶向微球中藥物含量測(cè)定的紫外分光光度法且對(duì)該方法進(jìn)行了考察，結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求；馬麗萍[15]等人申請(qǐng)的“復(fù)凝聚法制備的恩諾沙星明膠微囊”專利中也是使用紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行的含量測(cè)定，結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確可靠，本試驗(yàn)結(jié)果與之相一致。

綜上所述，紫外分光光度法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可行，可以用于測(cè)定恩諾沙星微囊制劑的藥物含量，適用于生產(chǎn)中恩諾沙星明膠微囊的質(zhì)量控制。

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(編輯：武英耀)

Determination of enrofloxacin gelatin microcapsules content by UV spectrophotometry

Su Xiaoqing, Zhang Liqi, Zheng Mingxue, Dai Haonan, Shi Chenjie, Bai Rui, Xi Rou, Gong Xin, Zhang Li, Xu Zhiyong

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]The aim of this paper was to establish an UV spectrophotometry method for the determination of enrofloxacin content in enrofloxacin gelatin microcapsules.[Methods]The specificity, linearity, accuracy and precision were tested in this study. [Results]A good linearity was obtained for enrofloxacin in the range of 2～16 μg/mL and the standard curvilinear equation was A=0.103 0C-0.028 0(r=0.998 8). The relative standard deviation(RSD) of precision test was 0.00%、0.14%、0.11%(n=3), the average recovery rate was 101.53%、98.03%、98.07%(n=3)and its RSD was 0.25%、0.05%、0.00%(n=3)，respectively.[Conclusion] The specificity, linearity, precision and recovery rate were all consistent with the request. The method could be used for the quality control of enrofloxacin gelatin microcapsules.

UV spectrophotometry, Enrofloxacin, Gelatin microcapsules

2016-11-23

2016-12-12

蘇曉晴(1992-)，女(漢)，山西忻州人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物傳染病診斷與防治

*通信作者：鄭明學(xué)，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:0354-6289829；E-mail:zhengmingxue288@163.com

山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(2016-11-03)

S85

A

1671-8151(2017)04-0258-05