王妍妍，張素仙，廉陽(yáng)秧，徐 勤，寇 蓬，魏 潔，楊麗華

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，云南 昆明 650101)

Twist在低氧微環(huán)境中宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

王妍妍，張素仙，廉陽(yáng)秧，徐 勤，寇 蓬，魏 潔，楊麗華

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，云南 昆明 650101)

目的 研究Twist在低氧微環(huán)境中宮頸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用。方法 以二氯化鈷處理Hela細(xì)胞模擬低氧微環(huán)境，細(xì)胞的形態(tài)變化、遷移能力分別應(yīng)用倒置顯微鏡及劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。Twist、Vimentin和低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在Hela細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 低氧處理后Hela細(xì)胞獲得了間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征；Hela細(xì)胞低氧組遷移率為(20.4±5.9)%，常氧組為(5.2±1.7)%(P<0.05)；低氧組Hela細(xì)胞HIF-1α、Twist、Vimentin表達(dá)均較常氧組顯著增高(P均<0.05)；低氧組Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist、Vimentin的表達(dá)兩兩均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 低氧條件下Hela細(xì)胞中Twist高表達(dá)，這可能與宮頸癌EMT發(fā)生有關(guān)。

宮頸腫瘤；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Twist；低氧誘導(dǎo)因子-1α； Vimentin；低氧

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)過(guò)程，其與細(xì)胞遷徙、侵襲能力增強(qiáng)及腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和耐藥的發(fā)生有關(guān)[1]。Twist是調(diào)控EMT的關(guān)鍵因素，在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。Twist與缺氧微環(huán)境中多種腫瘤的EMT發(fā)生相關(guān)，但其在宮頸癌EMT發(fā)生中的作用尚不清楚，本文通過(guò)探討低氧微環(huán)境中宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移能力的變化以及低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、Twist和Vimentin表達(dá)的相關(guān)性，以探討Twist在低氧微環(huán)境中宮頸癌EMT發(fā)生中發(fā)揮的作用，從而為宮頸癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 試劑和細(xì)胞株 人宮頸癌Hela細(xì)胞由昆明醫(yī)科大學(xué)云南省藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周軼平老師饋贈(zèng)。二氯化鈷購(gòu)自廣州金華大化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚、PVP封片液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人HIF-1α抗體、小鼠抗人Vimentin抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗人Twist抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔-TRITC抗體、山羊抗小鼠-FITC抗體以及濃縮型封閉用山羊正常血清購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用Hela細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按照培養(yǎng)方法換液傳代，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。細(xì)胞分為常氧組、低氧組，低氧組應(yīng)用二氯化鈷處理，二氯化鈷的終濃度為150 μmol·L-1，常氧組應(yīng)用一般培養(yǎng)基。

1.3 低氧對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 低氧組和常氧組細(xì)胞分別培養(yǎng)6 h后在倒置相差顯微鏡下觀察2組細(xì)胞的形態(tài)，然后照相。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)研究Hela細(xì)胞遷移能力 在培養(yǎng)皿培養(yǎng)Hela細(xì)胞，分為低氧組、常氧組，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%后，應(yīng)用刮片刮去部分細(xì)胞形成劃痕，用培養(yǎng)基洗去刮下細(xì)胞，照相，然后放置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后照相。

1.5 2組細(xì)胞HIF-1α、Twist和Vimentin表達(dá)及相互之間的關(guān)系 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期低氧組、常氧組細(xì)胞，消化后把細(xì)胞懸液置于玻片，制備細(xì)胞爬表面，甲醛固定細(xì)胞、應(yīng)用山羊血清封閉抗原、玻片分別滴加HIF-1α、Twist、Vimentin、Twist與Vimentin、HIF-1α與Vimentin混合一抗，然后4 ℃過(guò)夜，隨后滴加熒光標(biāo)記的相應(yīng)二抗，在室溫孵育，注意避光，最后加用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚液、應(yīng)用PVP封片劑封片，觀察染色情況，照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)；Spearman線性相關(guān)分析各指標(biāo)的相關(guān)性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 二氯化鈷作用于細(xì)胞后，Hela細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞間的空隙增加，突起變長(zhǎng)變細(xì)，細(xì)胞外形不規(guī)則、彎曲。見(jiàn)圖1。

圖1 2組Hela細(xì)胞形態(tài)比較(×100)

2.2 Hela細(xì)胞的遷移能力變化 低氧組應(yīng)用含150 μmol·L-1的二氯化鈷處理，常氧組應(yīng)用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后觀察結(jié)果，低氧組遷移率為(20.4±5.9)%，常氧組為(5.2±1.7)%，低氧組細(xì)胞遷移率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist和 Vimentin蛋白表達(dá)的變化及各因子間的關(guān)系 免疫熒光染色后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察各因子表達(dá)，HIF-1α染色呈紅色，陽(yáng)性染色以細(xì)胞核為主。Twist染色也為紅色，陽(yáng)性染色以細(xì)胞核為主。Vimentin染色呈綠色，主要在細(xì)胞質(zhì)。低氧組Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist、Vimentin表達(dá)均顯著高于常氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。為研究3個(gè)指標(biāo)在低氧狀態(tài)下的相關(guān)性，我們應(yīng)用雙重?zé)晒夥z測(cè)Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist與Vimentin表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三者均呈正相關(guān)。見(jiàn)圖2、3，表1、2。

圖2 Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist及Vimentin蛋白表達(dá)的變化 (×200)

圖3 2組Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist與Vimentin蛋白表達(dá)的關(guān)系(×200)

表1 2組Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist、Vimentin的表達(dá)

表2 低氧組Hela細(xì)胞中HIF-1α、Twist、Vimentin相互之間表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

惡性腫瘤有侵襲和轉(zhuǎn)移的特征，惡性腫瘤細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程都有EMT現(xiàn)象存在，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后極性喪失，細(xì)胞表型發(fā)生改變，上皮表型逐漸喪失，間質(zhì)表型表達(dá)增加，這可能是啟動(dòng)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵所在，Tanaka等[3]曾報(bào)道子宮內(nèi)膜癌存在EMT狀態(tài)，該狀態(tài)與子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

許多原因均可導(dǎo)致EMT發(fā)生，其中的一個(gè)重要始動(dòng)因素是低氧[4]，快速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其顯著的低氧微環(huán)境[5]，而HIF-1α是在低氧微環(huán)境中發(fā)揮作用的重要因子[6]。Twist是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，有研究報(bào)道Twist為HIF-1α的下游作用分子，在多種疾病的EMT發(fā)生中發(fā)揮重要作用，Du等[7]在研究腎臟纖維化中發(fā)現(xiàn)HIF-1α通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt/Snail信號(hào)激活HIF-1α/Twist-Bmi1通路促進(jìn)EMT發(fā)生，從而導(dǎo)致腎臟纖維化。Tsai等[8]報(bào)道HIF-1α通過(guò)Twist保持腫瘤細(xì)胞間質(zhì)表型。賈有娟等[9]也報(bào)道宮頸癌組織中Twist及HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，因此提示Twist在低氧微環(huán)境中宮頸癌EMT發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但未見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中Hela細(xì)胞被二氯化鈷處理導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的低氧，然后觀察二氯化鈷處理后Hela細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞外形的變化。另外，我們還檢測(cè)了細(xì)胞HIF-1α、Twist、Vimentin蛋白表達(dá)的變化，以探討Twist在低氧微環(huán)境中宮頸癌細(xì)胞EMT發(fā)生中的作用。二氯化鈷處理Hela細(xì)胞6 h后，我們觀察到Hela細(xì)胞突起變得更長(zhǎng)更細(xì)，細(xì)胞間間隙增寬，呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用二氯化鈷處理后的細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移能力及高Vimentin表達(dá)率。Vimentin被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志物，其表達(dá)的增高代表腫瘤細(xì)胞獲得了較強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。該結(jié)果說(shuō)明低氧條件下宮頸癌Hela細(xì)胞發(fā)生了EMT且其轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)了。本研究用免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)二氯化鈷處理后的Hela細(xì)胞HIF-1α、Twist、Vimentin表達(dá)增強(qiáng)，三者間表達(dá)呈正相關(guān)，提示低氧是宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的誘因之一，低氧微環(huán)境中HIF-1α表達(dá)增多，HIF-1α上調(diào)Twist蛋白可能是其主要機(jī)制。

綜上所述，宮頸癌在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，隨著腫瘤組織增大，腫塊內(nèi)部出現(xiàn)低氧環(huán)境，為適應(yīng)這種改變，HIF-1α作為細(xì)胞低氧保護(hù)元件被激活，HIF-1α通過(guò)上調(diào)Twist促進(jìn)Vimentin表達(dá)導(dǎo)致宮頸癌EMT發(fā)生，從而使宮頸癌細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移潛能。

[1] 呂文姣,周京旭.上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 腫瘤學(xué)雜志,2014,20(6):508-511.

[2] TANIA M,KHAN MA,FU J. Epithelial to mesenchymal transition inducing transcription factors and metastatic cancer[J].Tumour Biol,2014,35(8):7335-7342.

[3] TANAKA Y,TERAI Y,KAWAGUCHI H,et al. Prognostic impact of EMT (epithelial-mesenchymal-transition)-related protein expression in endometrial cancer[J].Cancer Biol Ther,2013,14(1):13-19.

[4] BARRIGA EH,MAXWELL PH,REYES AE,et al. The hypoxia factor Hif-1α controls neural crest chemotaxis and epithelial to mesenchymal transition[J]. J Cell Biol,2013,201(5):759-776.

[5] 關(guān)濤,田曉予,喬文艷.缺氧誘導(dǎo)因子-1α與婦科腫瘤[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2014,7(14):244.

[6] ARJUMAND W,SULTANA S. Role of VHL gene mutation in human renal cell carcinoma[J].Tumour Biol,2012,33(1):9-16.

[7] DU R,XIA L,NING X,et al. Hypoxia-induced Bmi1 promotes renal tubular epithelial cell-mesenchymal transition and renal fibrosis via PI3K/Akt signal[J].Mol Biol Cell,2014,25(17):2650-2659.

[8] TSAI CC,CHEN YJ,YEW TL,et al. Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down-regulation of E2A-p21 by HIF-TWIST[J].Blood,2011,117(2):459-469.

[9] 賈有娟.Twist和HIF-1α在宮頸癌中的表達(dá)及意義[D].青島:青島大學(xué),2011.

Role of Twist on the Cervical Cancer Epithelial Mesenchymal Transition in Hypoxic Microenvironment

WANG Yanyan,ZHANG Suxian,LIAN Yangyang,XU Qin,KOU Peng,WEI Jie,YANG Lihua

(DepartmentofGynaecology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101,China)

Objective To investigate the role of twist on cervical cancer epithelial mesenchymal transition (EMT) in hypoxia microenvironment.Methods Hypoxia microenvironment was mimicked by using cobalt chloride. The morphologies and the migration ability of Hela cells in hypoxia microenvironment were observed by invert microscopy and scratch test. The expressions of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α),Twist and Vimentin proteins in Hela cells were determined by immunofluorescence.Results The mesenchymal morphological characteristics of Hela cells showed in hypoxia microenvironment. The migration percentage in the hypoxia group was (20.4±5.9)%,and was (5.2±1.7)% in the normoxia group (P<0.05). The expressions of HIF-lα,Twist and Vimentin of Hela cells in the hypoxia group significantly higher than those in the normoxia group (P<0.05). There were significantly positive correlations among them in the hypoxia group (P<0.05).Conclusion The expression of Twist increased in hypoxia microenvironment,and is highly correlation with EMT,Twist may induce EMT of cervical cancer through Twist pathway.

cervical cancer; epithelial-mesenchymal transition; Twist; hypoxia inducible factor-1α; Vimentin; hypoxia

云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：2015Z074)

王妍妍(1989-)，女，碩士，主要從事婦科腫瘤的臨床研究。E-mail：942622967@qq.com

楊麗華(1972-)，女，教授，主要從事婦科腫瘤的臨床研究。E-mail：yanglihua0628@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.02.001

R737.33;R730.23

A

1673-5412(2017)02-0093-04

2016-06-21)