倪 奎

(安徽新聞出版職業(yè)技術(shù)學(xué)院 新聞傳播系，合肥 230601)

三種染色法對(duì)果蠅唾腺染色體制片優(yōu)化設(shè)計(jì)

倪 奎

(安徽新聞出版職業(yè)技術(shù)學(xué)院 新聞傳播系，合肥 230601)

采用果蠅三齡幼蟲(chóng)為試驗(yàn)材料，經(jīng)過(guò)剝離唾腺、解離、漂洗、染色、壓片處理后，通過(guò)顯微鏡觀察染色結(jié)果。染色步驟中，使用卡寶品紅染色法、孚爾根染色法及孔雀綠染色法三種染色方法對(duì)照醋酸洋紅染色法設(shè)定四組試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明卡寶品紅染色法、孚爾根染色法及孔雀綠染色法的染色效果比醋酸洋紅染色法的染色效果均有所提升。綜合考慮染色時(shí)間、實(shí)驗(yàn)操作、染色液的配置及染色效果四個(gè)方面，孔雀綠染色法染色時(shí)間少、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、染色液配置簡(jiǎn)單、染色效果好，使用孔雀綠染色法效率最高，可用于教學(xué)實(shí)驗(yàn)中。

黑腹果蠅;唾腺染色體制片;孔雀綠染色法;卡寶品紅染色法;孚爾根染色法

果蠅唾腺染色體是研究染色體結(jié)構(gòu)畸變, 基因定位及基因表達(dá)(mRNA合成) 的良好材料。高等學(xué)校在教學(xué)試驗(yàn)中一般把果蠅唾腺染色體制片實(shí)驗(yàn)列為遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)內(nèi)容，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)采用的是醋酸洋紅染色法，但其染色效果不佳，在教學(xué)試驗(yàn)中不利于學(xué)生的辨認(rèn)。本試驗(yàn)采用卡寶品紅染色法、孚爾根染色法及孔雀綠染色法三種染色方法對(duì)照醋酸洋紅染色法對(duì)其進(jìn)行探究改進(jìn)。

近些年來(lái)，很多學(xué)者都在該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化上做出一定的貢獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)材料選取、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中解離、染色及壓片幾個(gè)方面進(jìn)行了改進(jìn)。早在1987年美國(guó)學(xué)者M(jìn). Ashburner在他的著作中對(duì)果蠅進(jìn)行了詳細(xì)的介紹，且將書(shū)中內(nèi)容更新后于2005年發(fā)行了第二版。[1]在實(shí)驗(yàn)材料三齡幼蟲(chóng)的培養(yǎng)上，西北農(nóng)林科技大學(xué)遺傳工程實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出了個(gè)體肥大、身體強(qiáng)壯、生命力旺盛的三齡幼蟲(chóng)，其唾液腺發(fā)達(dá)，腺體細(xì)胞核大且染色體著色快。[2]在剝離唾腺操作上，吉首大學(xué)的張賢陰提出利用幼蟲(chóng)自身的回縮力，可巧妙地將唾腺取出。[3]在剔除染色體上的脂肪與解離兩個(gè)步驟上，1990年就有學(xué)者提出將上述兩個(gè)步驟先后順序互換，先解離，通過(guò)在唾腺上滴加一滴1mol/L鹽酸處理3分鐘后，再將脂肪剔除，這樣不僅可以更簡(jiǎn)單地將脂肪剔除也利于細(xì)胞分離和染色體伸展。[4]而在染色這一方面，很多學(xué)者進(jìn)行了探索，利用苯酚品紅染液代替醋酸洋紅染液，蘇州大學(xué)潘新法、徐慶宏使用不同濃度的苯酚品紅染液進(jìn)行染色，對(duì)比發(fā)現(xiàn)濃度為8%至12%時(shí)染色效果最佳，[5]周口師范學(xué)院趙錦慧、劉中華使用改良苯酚品紅染液發(fā)現(xiàn)染液濃度為6%，染色5到8分鐘效果最佳[6]。但要達(dá)到較好的染色效果，配置好染液后需放置兩周左右再使用。另有學(xué)者采用孚爾根染色法，較傳統(tǒng)方法取得了更好的效果，且有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)完善。[7]在壓片方面，實(shí)驗(yàn)教材指導(dǎo)用手指用力下壓，使染色體展開(kāi)[8]，然而對(duì)于學(xué)生不易掌握下壓力度。陜西師范大學(xué)王華峰、那冬晨提出采用解剖針敲擊蓋玻片，敲擊的力度比較容易掌握，且染色體容易分散展開(kāi)。[9]

1 試驗(yàn)內(nèi)容

本試驗(yàn)主要針對(duì)果蠅唾腺染色體制片實(shí)驗(yàn)中染色及后續(xù)步驟操作進(jìn)行探索改進(jìn)。在染色操作中，采用卡寶品紅染色法、孚爾根染色法及孔雀綠染色法三種染色方法對(duì)照醋酸洋紅染色法對(duì)果蠅唾腺染色體進(jìn)行染色，染色完成后進(jìn)行壓片，通過(guò)在顯微鏡檢查染色效果。具體試驗(yàn)的技術(shù)路線見(jiàn)圖1。

圖1 果蠅唾腺染色體制片與觀察

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料、試劑和器材 黑腹果蠅的三齡幼蟲(chóng)、卡寶品紅染色液、席夫試劑、孔雀綠染色液、醋酸洋紅染色液、生理鹽水、1 mol/L鹽酸、30%，45%濃度的醋酸溶液、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、解剖針、小燒杯、吸水紙等。

2.2 試驗(yàn)方法 果蠅三齡幼蟲(chóng)唾腺的剝離：取果蠅三齡幼蟲(chóng)置于載玻片上，滴一滴生理鹽水，左手持解剖針按在蟲(chóng)體后1/3處，右手持解剖針按在頭部黑點(diǎn)狀口器的后側(cè)，撕下頭部并帶出唾腺[10]。由于后面的實(shí)驗(yàn)操作因染色方法不同具體操作亦不相同，故以下將分別列出不同染色方法的實(shí)驗(yàn)具體操作。

2.2.1 醋酸洋紅染色法

(1)將取出的唾腺置于載玻片上，滴加一滴1mol/L鹽酸，解離2～3 min，將脂肪剔除;

(2)將唾腺轉(zhuǎn)移到干凈的載玻片上，滴加醋酸洋紅染色液，固定染色10min；

(3)蓋上蓋玻片，用濾紙先輕輕壓一下，吸去多余染液，置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用解剖針在蓋玻片上輕輕敲打，使唾腺染色體充分展開(kāi)；

(4)將制作好的裝片置于顯微鏡下觀察。

2.2.2 卡寶品紅染色法

(1)將取出的唾腺放在干凈的載玻片中央, 加一滴1 mol/L的鹽酸,解離3～5min，將脂肪剔除;

(2)用濾紙將鹽酸溶液吸干, 滴加一滴蒸餾水, 一分鐘后再將水分吸干, 漂洗3～4次;

(3)滴加1～2滴卡寶品紅染色液于漂洗好的腺體上;

(4)染色時(shí)間設(shè)定為3、4、5、6、7min五個(gè)梯度，另外再將一組染色時(shí)間設(shè)定為10min；

(5)染色完成后蓋上蓋玻片，固定好蓋玻片，用解剖針輕輕敲打，使染色體充分展開(kāi)；

(6)在顯微鏡下檢查制片效果。

2.2.3 孚爾根染色法

(1)取一小燒杯，向燒杯內(nèi)倒入一定量1mol/L鹽酸，將其置于恒溫水浴鍋中，溫度保持在60℃，另取一小燒杯盛席夫試劑；

(2)將唾腺轉(zhuǎn)移至盛鹽酸的小燒杯中，20～30s；

(3)將唾腺取出，并將脂肪剔除，用蒸餾水沖洗3次；

(4)將唾腺轉(zhuǎn)移至盛席夫試劑的小燒杯中，染色20min以上[11]；

(5)取出唾腺，水洗一次；

(6)將唾腺轉(zhuǎn)移至一干凈的載玻片，滴加一滴45%醋酸，蓋上蓋玻片，用解剖針輕輕敲打，使染色體充分展開(kāi)；

(7)在顯微鏡下檢查制片結(jié)果。

2.2.4 孔雀綠染色法

(1)將取出的唾腺放在干凈的載玻片中央, 加1滴1mol/L的鹽酸,解離3～5min，將脂肪剔除;

(2)用濾紙將鹽酸溶液吸干, 滴加一滴蒸餾水, 1min后再將水分吸干, 漂洗3～4次;

(3)滴加1～2滴孔雀綠染色液于漂洗好的腺體上;

(4)染色時(shí)間設(shè)定為3、4、5、6、7min五個(gè)梯度，另外再添加一組染色時(shí)間設(shè)定為10min;

(5)染色完成后將唾腺染色體轉(zhuǎn)移至另一載玻片上，滴加30%的醋酸，蓋上蓋玻片，固定好蓋玻片用解剖針輕輕敲打，使染色體充分展開(kāi);

(6)在顯微鏡下檢查制片效果。

3 結(jié)果與分析

通過(guò)顯微鏡下檢查制片結(jié)果，選取最好的照片作為本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，見(jiàn)圖2-5。

圖2 卡寶品紅染色法制片

圖3 孚爾根染色法制片

圖4 孔雀綠染色法制片

圖5 醋酸洋紅染色法制片

3.1 卡寶品紅染色法制片結(jié)果分析

卡寶品紅染色法與醋酸洋紅染色法相比較染色簡(jiǎn)便快速，分色清晰。染色體呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)無(wú)色或有極淡的紅色，染色效果有較大程度提升。采用滴染和浸染均可。用此法制得的染色體具有耐保存、高穩(wěn)定、持久不褪色的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)染色5、6、7、10min后效果無(wú)明顯差距，且好于染色3、4min，故采用卡寶品紅染色法時(shí)染色5min即可。染色液放置時(shí)間越長(zhǎng)，染色效果越好，通常染液可在常溫下存放兩年而保持穩(wěn)定不變質(zhì)。

缺點(diǎn)：其染色效果與鹽酸的解離過(guò)程密切相關(guān)。若解離時(shí)間太短, 細(xì)胞質(zhì)會(huì)不同程度的著色，導(dǎo)致觀察時(shí)染色體不夠突出；當(dāng)解離過(guò)度時(shí)， 染色體不易著色，背景也不會(huì)著色，可能觀察不到染色體。只有在合適的解離條件下染色體著色紫紅，細(xì)胞質(zhì)無(wú)色或有極淡的紅色。因此用此兩種方法實(shí)驗(yàn)染色，需要把握時(shí)間的精確度高，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽酸解離的時(shí)間在3min左右各種效果最佳。

3.2 孚爾根染色法制片結(jié)果分析

孚爾根染色法染色時(shí)通常只對(duì)細(xì)胞核和染色體作用，使細(xì)胞核和染色體著色，而不對(duì)細(xì)胞質(zhì)作用。染色體著色均勻，且可與其背景形成較大的反差，使染色效果有較大提升且易于觀察。

缺點(diǎn)：(1)染色過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，需要20min以上。由于染色時(shí)間長(zhǎng)，席夫試劑中所含的鹽酸會(huì)使染色體過(guò)度軟化，在壓片時(shí)需要注意解剖針敲擊的力度，謹(jǐn)慎操作，若操作不當(dāng)可能會(huì)破壞染色體。 (2)水解條件比較苛刻，溫度要嚴(yán)格控制在60℃左右，波幅不可超過(guò)±2℃。溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成水解濃度、糖和醛基間的鍵破壞過(guò)大，醛基流失到水解液中，會(huì)使染色體著色不均勻或染色過(guò)深，細(xì)胞質(zhì)也會(huì)著色或者出現(xiàn)大小不等的紅色小粒；反之，染色體著色不夠深，且細(xì)胞質(zhì)中可能有其他醛基存在，而呈現(xiàn)擴(kuò)散的顏色，會(huì)導(dǎo)致無(wú)法清晰觀察染色體。只有水解合適，才能使染色體著色較深，而細(xì)胞質(zhì)淺著色或不顯示任何顏色，達(dá)到良好的染色效果。孚爾根染色法實(shí)驗(yàn)過(guò)程過(guò)于復(fù)雜，因教學(xué)試驗(yàn)中，學(xué)生需要實(shí)驗(yàn)的時(shí)間較長(zhǎng)，不利于學(xué)生快速的看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是比較適合顯微攝影，拍攝染色效果很好。

3.3 孔雀綠染色法制片結(jié)果分析

孔雀綠染色法與醋酸洋紅染色法相比較，染色顏色深，分色清晰，染色效果有較大提升。也更容易染色，且染色簡(jiǎn)便快速。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用孔雀綠染液染色5min效果較染色3、4min效果好，與染色6、7、10min效果無(wú)明顯差別，故采用孔雀綠染色法時(shí)染色5min即可。

4 討 論

4.1 三種染色方法染色時(shí)間比較

卡寶品紅染色法與孔雀綠染色法染色時(shí)間只需要5min左右即有很好的染色效果，較醋酸洋紅染色法染色耗時(shí)少；孚爾根染色法需要至少20min，耗時(shí)最長(zhǎng)。在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可方便使用卡寶品紅染色法與孔雀綠染色法染色此兩種方法，時(shí)間較短，以便于學(xué)生很快看到實(shí)驗(yàn)效果，而孚爾根染色法染色時(shí)間較長(zhǎng)，不利于課堂實(shí)驗(yàn)。

4.2 三種染色方法實(shí)驗(yàn)操作比較

卡寶品紅染色法與醋酸洋紅染色法相比操作步驟相似；孚爾根染色法操作較醋酸洋紅染色法繁瑣且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要控制好實(shí)驗(yàn)條件；孔雀綠染色法操作步驟與醋酸洋紅染色法相似，但是孔雀綠染液易揮發(fā), 所以在染色過(guò)程中需要適時(shí)滴加染液。故從操作步驟上來(lái)說(shuō)，卡寶品紅染色法最為簡(jiǎn)單易操作，而孚爾根染色法步驟最為繁瑣。

4.3 三種染色方法染色液的配置比較

卡寶品紅染色液: 稱(chēng)3 g堿性品紅溶于100 mL70%酒精中得到原液A；取10 mL原液A, 加入到90 mL5%苯酚水溶液中得到原液B；再取55 mL原液B,加其中入6mL冰醋酸和6 mL甲醛得到原液C；最后取20 mL原液C,加入80 mL45%的醋酸和1 gD-山梨醇即制成卡寶品紅染色液。

席夫試劑: 稱(chēng)取0.5 g堿性品紅, 加到100 mL已煮沸的蒸餾水中溶解, 待溶液冷卻到50℃時(shí), 將其過(guò)濾到一棕色試劑瓶中,等溶液冷卻至25℃時(shí),加入10 mL，1 mol/L鹽酸和1 g偏重亞硫酸鈉, 置于黑暗處, 靜置18h后溶液呈草黃色即可使用。[9]

孔雀綠染色液: 稱(chēng)取1 g孔雀綠溶于19 mL水中,然后加入80 mL純酒精、1 mL冰醋酸, 過(guò)濾后即可使用。

卡寶品紅染色液配置需要原材料多，配置過(guò)程繁瑣，耗時(shí)稍多；席夫試劑配置所需原材料少，配置過(guò)程較繁瑣且耗時(shí)很長(zhǎng)；孔雀綠染液配置所需原材料少，配置過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)較少。

4.4 三種染色方法染色效果比較

卡寶品紅染色法、孚爾根染色法、孔雀綠染色法染色效果都好于醋酸洋紅染色法染色效果。其中卡寶品紅染色法和孔雀綠染色法染色效果相當(dāng)，孚爾根染色法染色效果最佳(見(jiàn)表1)。

表1 卡寶品紅染色法、孚爾根染色法、孔雀綠染色法比較分析

5 結(jié) 論

綜合考慮染色時(shí)間、實(shí)驗(yàn)操作、染色液的配置及染色效果四個(gè)方面，孔雀綠染色法染色時(shí)間少、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、染色液配置簡(jiǎn)單、染色效果好，孔雀綠染色法效率最高。在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，以便于學(xué)生在試驗(yàn)中很快得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但孚爾根染色法實(shí)驗(yàn)時(shí)間校長(zhǎng)，步驟繁瑣，但實(shí)驗(yàn)得出的效果最佳，染色界面清晰，在商業(yè)制片中可用此種方法。

[1] Ashburner M,Golic Kent ,Hawley R.Scott .Drosophila:A Laboratory Handbook[M].2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,2005:1- 81.

[2] 胡甘.用于果蠅唾腺染色體實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)方法[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù),2007(5):38- 39.

[3] 張賢陰.果蠅唾腺染色體制片的小技巧[J].生物學(xué)通報(bào),2004,39(4):61.

[4] 許祖國(guó).果蠅唾腺染色體實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)[J].生物學(xué)雜志，1990(2):44- 45.

[5] 番新法,許慶宏.不同濃度的苯酚品紅對(duì)果蠅唾腺染色體的染色效果[J].生物學(xué)雜志,2002,19(5):26- 27.

[6] 趙錦慧,劉中華.改良苯酚品紅染液對(duì)果蠅唾腺染色體制片效果的影響[J].生物學(xué)教學(xué), 2011, 36 (4): 41- 42.

[7] 劉麗影,劉文靜,邵紅.果蠅唾腺染色體四種染色方法的比較[J].佳木斯大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007,25(3):424- 426.

[8] 劉祖洞,江紹慧.遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2版.北京:高等教育出版社,1987:9- 13.

[9] 王華峰,那冬晨.果蠅唾腺染色體觀察實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革與探索[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2009(5):69- 70.

[10] 郭善利,劉林德.遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:科學(xué)出版社,2004:25- 28.

[11] 薛小橋,金珊.用Feuglen染色法制做果蠅唾腺染色體[J].生物學(xué)通報(bào),2002(2):23.

[責(zé)任編輯：張永軍]

Improved Design of the Slide Making of Drosophila Salivary Gland Chromosome Based on three Staining Methods

NI Kui

(Journalism and Communication, Anhui News and Publishing Vocational College, Hefei 230601，China)

Adopting the third instar larvae ofDrosophilamelanogasteras test material，this test obtained the dyeing results by observing microscopic after stripping salivary glands, dissociation, rinsing, dyeing and tableting process. In the process of dyeing, four groups of test were designed by comparing the carbol fuchsin dyeing, Feulgen dyeing and malachite green dyeing method with the carmine staining dyeing. The results show that the carbol fuchsin dyeing, Feulgen dyeing and malachite green dyeing have been more effective than that of the carmine staining dyeing. Taken into the overall consideration of dyeing time, experimental operation, preparation of the dyeing and dyeing effects, the malachite green dyeing has the best efficiency with less time, simpler experimental operation and preparation of dyeing and better dyeing effects, which can be applied in teaching experiments.

Drosophilamelanogaster;salivary gland chromosome preparation;malachite green dyeing;carbol fuchsin dyeing;Feulgen dyei

2016-11-28

2017-02-23

2015年高校人文社科重點(diǎn)項(xiàng)目“基于景觀生態(tài)學(xué)的高校校園規(guī)劃研究”(SK2015A688)資助。

倪 奎(1980— )，男，安徽桐城人，安徽新聞出版職業(yè)技術(shù)學(xué)院新聞傳播系講師。

Q343.21

A

2096-2371(2017)02-0079-05