徐國棟

（天津市動物疫病預防控制中心 天津 300402）

豬流行性腹瀉疫苗研究進展

徐國棟

（天津市動物疫病預防控制中心 天津 300402）

2011 年前后至今，豬流行性腹瀉已經成為危害養(yǎng)豬業(yè)的最重要疫病之一，它造成哺乳仔豬和斷奶仔豬的高病死率，既往研究和臨床防治效果顯示：通過免疫母豬使仔豬獲得高水平被動免疫保護是降低仔豬群高病死率的最佳方法，故筆者對當前豬流行性腹瀉常規(guī)疫苗（滅活疫苗和弱毒疫苗）和基因工程疫苗的應用效果和研究進展進行綜述，以期為養(yǎng)殖實踐中豬流行性腹瀉的有效防治提供可靠依據。

豬；流行性腹瀉；疫苗

豬流行性腹瀉病毒 （Porcineepidemicdiarrhea virus,PEDV）屬尼多病毒目、冠狀病毒屬，病毒核酸是具有感染性的線性單股正鏈無節(jié)段 RNA，全基因組5'端有帽結構（cap）,同多數(shù)冠狀病毒，5'端有 Kozak序列（GUUCAUGC），3'端有 poly 尾，共有 27000～33000 個核苷酸（nt），經典毒株 PEDVCV777 株基因組全長 28033nt。病毒基因組序列從 5'～3'的 6個 ORF 分 別 是 ：ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N,分別編碼復制酶多聚蛋白 lab（pplab,非結構蛋白）、S蛋白（纖突蛋白）、ORF3 蛋白（為非結構蛋白，可能與毒力相關）、E 蛋白（小包膜蛋白，又稱 sM 蛋白）、M 蛋白（膜糖蛋白）和 N 蛋白（核衣殼蛋白）。其中 S蛋白在結構蛋白中含量最高, 是最重要的 PEDV 保護性抗原。

冠狀病毒屬的傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritisvirus，TGEV）S 蛋白可被裂解為 S1 區(qū)和 S2 區(qū)，PEDVS 蛋白缺乏蛋白水解位點而不能被裂解，但仍被人為地劃分為 S1（抗原區(qū)，l-735aa）和S2 區(qū)（膜融合區(qū)，736-1383aa）。S1 區(qū)的 3 個具有高親 和 力 的 抗 原 表 位 是 ：S1P1（248-280aa）、S1P2（442-499aa）、S1P3 （679-742aa）,有人認為 S1 蛋白的 S1D 區(qū) （636-789aa） 有兩個 B 細胞抗原表位：S1D5 （744-759aa）、S1D6 （756-77laa）。 此 外 ，與TGEVS 抗原中和位點比較后，認為 PEDVS 基因中有 1個重要的中和抗原位點基因，該基因位點所編碼的部分 S蛋白具有免疫原性，是保護性抗原，能誘導機體產生中和抗體，被稱為“COE 基因”，自 5'端起可依次分為 COE1、COE2、COE3。

2011 年前后至今，由 PEDV 引起的豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea，PED）在中國大 陸、臺灣地區(qū)及其它國家持續(xù)流行，新生仔豬的高病死率造成了嚴重的損失。就當前國內豬群中 PED 的防治效果而言，疫苗免疫仍是控制該病發(fā)生、流行和降低高病死率的最佳方法，在此，筆者就 PEDV 疫苗的應用效果及研究進展綜述如下：

1 常規(guī)疫苗

1.1 滅活疫苗

1993 年，王明等用 PEDVS 株（分離自上海市某豬場）接種仔豬后取小腸及內容物，將其滅活后作為制備氫氧化鋁滅活疫苗的抗原來源，該疫苗經后海穴免疫、以 PEDVCV777 株口服攻毒后發(fā)現(xiàn)：對 3 日齡、22 日齡仔豬接種后的主動保護率分別為77.78%（7/9）、85%（17/20），只是有的免疫豬出現(xiàn)了一過性腹瀉；對 3 日齡仔豬的被動保護率為 97.06%（33/34）。1994 年，馬思奇等將 PEDVCV777 株經Vero 細胞培養(yǎng)后，以 PEDVCV777 株為抗原研制成氫氧化鋁滅活苗，經后海穴免疫、PEDV 滬株強毒攻毒后發(fā)現(xiàn)，對 3日齡仔豬接種后主動免疫保護率為85.18%（23/27）、被動免疫保護率為 85%（17/20）。1995 年，馬思奇等將細胞培養(yǎng)的 TGEV 弱毒株和PEDVCV777 株作為抗原，研制成 TGE-PED 二聯(lián)氫氧化鋁細胞滅活疫苗，對實驗豬后海穴免疫、PEDV滬株強毒口服攻毒后發(fā)現(xiàn)：對 3～5日齡仔豬接種后的主動免疫保護率為 88.89%（32/36）。

1.2 弱毒疫苗

1995 年，童昆周等將 PEDV-G1 強毒株經 Vero細胞傳代，再經 pK15 和 ST 細胞交替?zhèn)鞔螅@得了 PEDV-P83 弱毒株，將該弱毒液以口服、頸肌注射方法免疫 8～10 日齡仔豬后，以原強毒株攻擊，結果兩組主動保護率分別為 87.5%（13/14），100%（8/8），總保護率為 95.46%（21/22）。1998 年，佟有恩等將 PEDVCV777 株強毒株傳代適應于 Vero 細胞系，此后將適應株在仔豬腎原代細胞傳代克隆純化，將獲得的弱毒經實驗豬后海穴免疫、PEDV 滬株強毒攻毒后發(fā)現(xiàn)主動免疫保護率為 95.92%（47/49）,被動免疫試驗總保護率為 96.2%（76/79）。1999 年，佟有恩等用細胞培養(yǎng)的 PEDVCV777 株克隆弱毒株和 TEGV 華毒株克隆弱毒株制成 TEG-PED 二聯(lián)弱毒疫苗，經后海穴免疫、PEDV 滬株強毒攻毒后發(fā)現(xiàn)，對 3 日齡仔豬的主動免疫保護率為 100%（24/24）、3～4 日齡仔豬的被動免疫保護率為 100%（25/25）。 同 年 ， 李 樹 根 等 用 弱 毒 疫 苗 株PEDV-G1P83 和弱毒疫苗株 TGEV-AG1 研制成PED-TGE 二聯(lián)弱毒疫苗,用該疫苗分 3 次免疫母豬（產前6周口服、產前 4周和2周肌肉注射免疫）后，用 PEDV-G1 強毒免疫母豬所產 2～3 日齡仔豬，結果發(fā)現(xiàn)該疫苗對 PED 的被動免疫保護率為90.84%（19/21）；用該疫苗對 8～10 日齡仔豬口服免疫，在 28 日齡時用 PEDV-G1 強毒攻擊，結果發(fā)現(xiàn)該疫苗對 PED 的主動保護率達 100%（9/9），此后的田間試驗也顯示出良好的免疫效果。2013 年，王靚靚分離并保存的 PEDV（HLJBY 株）種毒制備及其特性進行了研究，通過優(yōu)化胰酶含量（1～5μg/mL）和吸附時間（1.5h），在提高 Vero 中的病毒滴度，同時還降低了病毒的致病性，最終建立了適宜的 PEDV細胞培養(yǎng)方法。同年，高楊坤對山東省某規(guī)模場新生仔豬發(fā)生的 PED 進行了防治，方法是用 PEDV CV777 弱毒株培養(yǎng)液對生后仔豬灌服 2h 后再進行哺乳，結果 20 窩（共 200 頭）超前免疫仔豬到 11 日齡時的成活率在 63.3%～78.3%間，20 窩 （共 200頭）3日齡口服免疫的仔豬到 11日齡時的成活率在38.3%～66.7%間，由此認為發(fā)生腹瀉的豬場有必要以高效價疫苗進行超前免疫。同年，田野等將分離鑒定的 PEDVGD12 株經 72 代 Vero 細胞馴化后得到 GD-R72 毒株，免疫 3 頭仔豬后出現(xiàn)了輕微的腹瀉癥狀，但未出現(xiàn)死亡，且在強毒攻擊后第 3 天全部康復，推測獲得了一株較理想的弱毒苗候選株。2014 年，張海明等將 PEDVCH/GDGZ/2012（廣東省高州株）強毒株經 Vero 細胞 70 次傳代后發(fā)現(xiàn)：病毒所致細胞病變明顯減弱，用該病毒株以滴鼻或滴鼻加肌注方式免疫 3日齡仔豬后出現(xiàn)了輕微腹瀉，隨后用原強毒株攻擊后只出現(xiàn)了短暫的腹瀉，腸道受損程度明顯輕于對照組。

2 基因工程疫苗

2.1 核酸疫苗

2011 年，斯琴高娃分別構建重組真核表達質粒pVAX1-PEDVS、pVAX1-PEDVS1、pVAX1-pIL-18（pIL-18，豬白細胞介素 -18）,以間隔 2 周、3 次股內側肌肉注射免疫的方法進行了單組或聯(lián)合組免疫試驗，隨后對血清 IgG 含量、外周血和脾臟 T 淋巴細胞增殖功能、外周血和脾臟T淋巴細胞毒性作用、外周血 IFN-Y 和 IL-4 表達量等免疫學指標進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)構建的 S組和聯(lián)合免疫組多數(shù)免疫指標都高于 S1 組,聯(lián)合免疫組疫苗誘導了更高的細胞和體液免疫應答，認為 pIL-18 基因可作為PEDVS 抗原基因分子佐劑。同年，孟凡丹分別構建了 TGEVS1 基因 （S 基因 N 端部分，2106bp）和PEDVS1 基 因 （CV777 株 S 基 因 1-2367bp）的pIRES-T1-P1 二 聯(lián) 核 酸 疫 苗 、TGEVS1 基 因 和PEDVS 全長基因（4149bp）的 pIRES-T1-P2 二聯(lián)核酸疫苗，以間隔 14d、連續(xù) 3 次在后肢雙內側股四頭肌處注射免疫 6～8周齡昆明小鼠，用淋巴細胞增殖實驗、流式細胞術、ELISA 等方法對小鼠機體的動態(tài)免疫學指標進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)：兩種聯(lián)苗均能誘導小鼠機體產生明顯體液免疫和細胞免疫，而以 T1-P2 疫苗誘導的免疫應答較強。

2.2 病毒載體疫苗

2007 年，韋顯凱構建 3 個可表達 PEDVS 蛋白不同位點的重組腺病毒,分別命名為 rAD-S1-638、rAD-S498-368 、rAD-S639-1384，將重組病毒連續(xù)2 次、相隔 14d 皮下免疫雌性小鼠，以 ELISA、中和試驗、脾細胞轉化試驗測定免疫小鼠的免疫應答，結果發(fā)現(xiàn)：脾細胞增殖反應較弱，但血清抗體（尤其是 rAD-S498-368 組）較高。2012 年，焦茂興等分別構建了含有 PEDVsM、M 和 S 基因的重組腺病毒，3種腺病毒共感染 Vero 細胞后，取表達上清液以肌注或口服免疫小鼠，再以 Westernblotting 法測定免疫小鼠血清后發(fā)現(xiàn)兩種免疫方式均可誘導抗體產生，即 PEDV 的 sM、M 和 S 基因能在靶細胞內表達并保持其免疫原性。2013 年，武存霞參考 NCBI數(shù)據庫中公布的 PEDVJS-2004-2 株 S 蛋白基因序列,構建了能夠表達 S1 基因片段的重組豬痘病毒rSPV-Sl，分別在 1、14、28d 用該疫苗注射免疫 ICR小鼠，以病毒中和試驗在免疫小鼠體內檢測到抗PEDV抗體。

2.3 細菌載體疫苗

2．3．1 乳酸菌疫苗 2008 年，葛俊偉用 8 個構建的表達 PEDV 免疫保護性抗原蛋白的重組乳桿菌以每 2周 1 次、每次持續(xù) 3d、連續(xù) 3 次口服的方法免疫小鼠，用 ELISA 方法檢測小鼠新鮮糞便、血液、眼沖洗物、鼻腔沖洗液、外生殖道沖洗液等樣品中的 slgA和血清中的 IgG 水平，發(fā)現(xiàn)免疫后均產生了高水平的抗體，通過淋巴細胞增殖試驗和細胞因子測定發(fā)現(xiàn)疫苗同時誘導了明顯的細胞免疫，且發(fā)現(xiàn)構建的細胞表面表達型疫苗比分泌表達型疫苗能誘導更好的免疫應答，兩類疫苗均能刺激小鼠高水平的黏膜免疫和細胞免疫應答。同年，董麗娜自疑似 PED病豬腸病料中擴增到長度為 50lbp 的 PEDVCOE 基因，其序列與 PEDVCV777 株同源性達 99.4%，在此基礎上構建了可表達 COE 基因的重組乳酸乳球菌pNZ8149-COENZ3900，用 Westernblot和間接免疫熒光方法檢測發(fā)現(xiàn)：重組菌中的目的蛋白定位在菌體表面，具有反應原性。2009 年，胡桂學等將董麗娜等制備的重組乳酸菌誘導培養(yǎng)，再分別用菌液以間隔 2周、連續(xù) 3次口服的方法對 7周齡仔豬和妊娠80d 的母豬進行免疫，用間接 ELISA 法對免疫后15～20d 的仔豬血清 IgG 和腸黏膜 SIgA、母豬生產后初乳中 SIgA 進行測定，結果發(fā)現(xiàn)相關抗體水平明顯升高。2011 年，董浩等將構建的 PEDV-COE-GFP NZ3900 重組乳酸乳球菌經口服途徑接種 6～8 周齡、體重約 20g雄性 BALB／c 小鼠，以免疫熒光法觀察黏膜涂片該菌在胃腸黏膜的定植情況，結果發(fā)現(xiàn)該菌在不同腸段分布并不均勻，以胃、結腸內菌量較高，但已經定植在胃腸黏膜不同部位菌量不隨時間延長發(fā)生變化。同年，汪淼等將構建可以表達與 PEDVCOE 基因位置相同的 ps420（1495～l914）bp 基因重組乳酸乳球菌，將該重組菌以間隔 14d連續(xù) 3 次、每次連續(xù) 3d 灌服家兔，再用中和試驗檢測家兔血清中和 IgG，發(fā)現(xiàn)該重組菌誘導較高水平的體 液 免 疫 應答。 2013 年， 訾玉 華 以 PEDV CH-GZH 株（江西贛州）S 基因為靶基因，構建重組乳酸菌 pMG36n/COE1NZ9000、pMG36n/COE2NZ9000、pMG36n/COE3NZ9000,經 SDS-PAGE 凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，重組菌均可表達相關抗原。同年，趙德等構建可表達 PEDVS 基因保護性抗原片段 C-COE 基因的重組乳酸菌，將誘導表達的重組乳酸菌按連續(xù)3次、間隔 1 周口服或皮下注射免疫 SPF 級雌性Balb/c 小鼠，經 ELISA 方法檢測小鼠血清抗體及IFN-γ 含量，結果發(fā)現(xiàn)重組菌誘導了體液免疫和細胞免疫：血清抗體和 IFN-γ 水平較高，且口服組指標均高于注射組（P＜0.05）。2014 年，徐波等構建了TGEV、PEDV 融合 S 基因重組質粒 pUCm-T-TPs，在此基礎上構建了重組乳酸乳球菌 L.lactisNZ9000/ pRNA48-TPs，使融合基因 TPs得以表達，并對乳酸乳球菌細胞總蛋白進行了提取，其后，分別用口服重組菌液和注射重組蛋白的方法免疫日本大耳白兔，口服時按 2 次 /周、連續(xù) 4 周灌胃誘導表達 TPs基因的重組菌菌液方法進行，注射時按 1 次 /周、連續(xù)3周肌肉注射弗氏完全佐劑或不完全佐劑加重組表達蛋白方法進行，對免疫兔血清用 Western-blot方法進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)口服組、注射組兔體內均產生了 TPs蛋白抗體。

2．3．2 減毒沙門氏菌疫苗 2011 年，徐麗麗自腹瀉豬糞便中擴增到 PEDVCOE 基因和 SD 基因，構建了重組沙門氏菌 C501-COE、C501-SD，目的蛋白可以在重組菌中分泌表達，分別將重組菌以口服或注射的方式免疫 BalB/c 小鼠，并在 2 周后對部分免疫小鼠進行了強化免疫，通過對血清 IgG、腸道黏膜sIgA、脾細胞分泌的 IFN-γ 水平檢測發(fā)現(xiàn)：小鼠體內產生了體液免疫和細胞免疫。2012 年，廖曉丹用四川分離株 PEDV(SC-L 株)和 TGEV（SC-H 株）作為種毒，構建了攜帶 PEDVS1 基因、TGEVS 基因、同時攜帶 PEDVS1 和 TGEVS 基因的三種重組減毒沙門氏菌疫苗，對小鼠連續(xù) 3次口服免疫 14d后，以間接 ELISA 方法檢測體內兩種抗原（PEDVS1蛋白和 TGEVS 蛋白） 的血清 IgG 和腸道 sIgA 水平，結果發(fā)現(xiàn)三種疫苗均可誘導免疫小鼠產生高水平的抗體，且發(fā)現(xiàn)單基因混合免疫組抗體水平較高。同年，唐瑩參照 PEDVCV777 株序列，構建了減毒沙門氏菌遞呈的 PEDVS/M 雙基因核酸疫苗SL7207（pVAXD-PSl-PM）和單基因核酸疫苗SL7207（pVAXD-PSl）、SL7207（pVAXD-PM），分別 將 疫 苗以 2 周 1 次、連續(xù) 3 次口服免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)部分小鼠免疫 1～3d 后出現(xiàn)食欲降低、精神不振和扎堆等癥狀,但剖檢未見實質器官出現(xiàn)異常病變。以間接ELISA 法對疫苗誘導的 PEDV 血清 IgG、腸道 sIgA進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)免疫 4～6周后抗體水平持續(xù)上升，6 周時達到最高，在整個免疫過程中，混合單基因疫苗免疫組免疫學指標始終優(yōu)于雙基因組免疫組，同時，通過對 γ- 干擾素的檢測發(fā)現(xiàn)兩種免疫方法均誘導了細胞免疫。同年，任玉鵬參照CV777 株序列，構建了攜帶 M、N 雙基因共表達載體的豬霍亂減毒沙門氏菌活載體疫苗，分別以間隔2周，連續(xù) 3 次口服的方法免疫小鼠，用 ELISA 方法分別檢測血清中 IgG、糞便中 sIgA、血清中 γ- 干擾素和白介素 4的水平，結果發(fā)現(xiàn)第 21天起血清抗體水平明顯升高，但未能達到商品滅活疫苗所激發(fā)的抗體水平，疫苗可誘導黏膜免疫，同時，血清中γ-干擾素和白介素4兩種細胞因子都顯著升高,即該疫苗同時誘導了細胞免疫。2014 年，QigaiHe將自 PEDVCV777 株擴增的 SD 和 COE 基因在質粒 pYA3493 上表達后，獲得了兩種可以在菌體表面表達目的基因的重組減毒沙門氏菌，分別命名為C501-COE 和 C501-SD, 將上述兩種菌以注射或口服方式免疫小鼠，結果發(fā)現(xiàn)兩種疫苗在不同免疫途徑下均可誘導小鼠機體產生體液免疫（黏膜 IgA 和血清 IgG）和細胞免疫，只是肌肉注射免疫后 IgG 滴度較高，口服免疫后 IgA 滴度較高,重組疫苗應用在養(yǎng)殖生產中未引起免疫豬的副作用，可將流行 PED的豬場豬群病死率從原來的 80%降低到 20%～50%，腹瀉率從原來的 100%下降至 18%～30%，由此認為這兩種重組菌可作為候選疫苗。

2．3．3 大腸桿菌載體疫苗 2013 年，楊榕等自安徽省某豬場采集的病料擴增出 PEDVCOE 基因, 在原核表達載 pET-32α 中克隆后，經大腸桿菌 Rosetta 誘導表達，得到了與 COE 基因相應的具有免疫活性的重組蛋白。

1）國內常規(guī)疫苗研究和應用時間較長，前期動物實驗顯示出良好的免疫效果，但在 2011 年后，養(yǎng)殖一線的從業(yè)者即便反復應用滅活疫苗或弱毒株疫苗免疫母豬群，也不能為新生仔豬提供強有力的被動免疫保護，以致新生仔豬 PED 的發(fā)生愈演愈烈。其原因可能與下述因素有關：①近期流行的PEDV 確實發(fā)生較大的變異，經典毒株制成的疫苗不能提供全面免疫保護；②現(xiàn)有疫苗抗原含量偏低；③豬群存在較嚴重的免疫抑制，現(xiàn)有疫苗不能誘導強有力的免疫。

2）當前基因工程疫苗尚處于研究階段，多數(shù)基因工程疫苗需要持續(xù)長時間、多次接種才能誘導動物機體產生有效的免疫力，這在養(yǎng)殖一線是不便捷的，而當前新生仔豬發(fā)生腹瀉后將迅速脫水致死，顯然對生后仔豬免疫此類疫苗來達到有效防治目的并不及時，此外，使用此類疫苗免疫母豬使生后仔豬獲得被動免疫的動物試驗研究較少，因此此類疫苗大量應用于養(yǎng)殖一線尚待時日。筆者認為：疫苗中充足的抗原含量是保證良好免疫效果的最重要因素，例如高抗原含量的滅活疫苗，即便頸部肌肉免疫母豬，也可使新生仔豬獲得強有力的被動免疫保護，同時還可避免后海穴免疫造成的母豬注射部位的膿腫。

（略）

（配圖來自網絡）

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.02.001