范文奇，要志宏，申麗媛，聶相珍，李波

(揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127)

豆粕多糖的酶法提取工藝研究

范文奇，要志宏，申麗媛，聶相珍，李波

(揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127)

試驗利用纖維素酶提取豆粕多糖，并利用苯酚-硫酸法測定樣品中多糖的含量，選取料液比、酶解溫度、酶解時間、pH值、纖維素酶添加量為試驗條件，通過試驗確定單因素的最佳試驗條件，同時在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，確定最佳試驗組合。兩次試驗結果顯示：酶法提取豆粕多糖的最適試驗條件為酶解時間90 min，酶解溫度60 ℃，pH 5.0，纖維素酶添加量1.0%，料液比1∶20，多糖得率達到14.92%。

提取工藝；豆粕多糖；纖維素酶；苯酚-硫酸法

大豆多糖類物質具有膳食纖維的特性，對增進人體健康有極大作用[1]；在肉制品、米面食品、酸性飲料中也有廣泛應用[2]。在水產品中添加豆粕作為飼料，可產生對人體相同的生理作用[3]；豆粕發(fā)酵后，其蛋白酶的酶活力顯著提高[4]。豆粕的生產利用率低，進行多糖提取是其加工的好去處。大豆多糖的提取工藝，常用水、稀酸和稀堿作為提取劑，或采取膜過濾法。常規(guī)方法可能導致浸提劑與豆粕多糖發(fā)生反應，降低其得率[5]。本文所用的酶法提取的優(yōu)勢顯著，使多糖物質更易溶出，再加上水浴提取的試驗方法，酶法提取的優(yōu)勢顯著，在其他原料提取多糖的辦法中也是較好的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖標準溶液(稱取一定量的葡萄糖放于鋁盒中，在105 ℃的鼓風干燥箱中干燥3 h至恒重，取出后置于干燥器中，待溫度下降，準確稱取1.000 g葡萄糖于1 L容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻)；纖維素酶(酶活力50000 U/g，江蘇銳陽生物科技有限公司)；6 mol/L鹽酸溶液；2 mol/L氫氧化鈉溶液；6%的苯酚溶液；98%的濃硫酸；豆粕(來源于山西農業(yè)大學晨曦市場)；蒸餾水。

1.2 設備和儀器

FZ102型微型植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；OZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；2100型分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；離心機 北京雷勃爾離心機有限公司；60目篩、DHG-9243BS-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；廣泛pH試紙、精密試紙pH 0.5～5.0 鎮(zhèn)江市化劑廠；電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

豆粕粉→加蒸餾水溶解→添加纖維素酶→水浴浸提→離心分離取上清液→調節(jié)pH值沉淀蛋白→離心分離取上清液→大豆多糖水溶液[6]。

1.3.2 試驗測定原理

糖類物質與濃硫酸作用脫水，生成糠醛或糠醛衍生物，糠醛及其衍生物進一步與苯酚反應，生成黃橙色的有色物質，在不同濃度下，顏色深淺不一，而其吸收值與糖濃度會呈現(xiàn)線性關系[7，8]，故可以準確得到多糖得率。

1.3.3 葡萄糖標準曲線的繪制

分別取葡萄糖標準溶液0,2,4,6,8,10 mL至6個100 mL容量瓶中，進行定容。6種濃度的溶液作為葡萄糖用液，之后各取1 mL溶液于6個試管中，加入6%苯酚溶液1.0 mL，再快速加入濃硫酸5.0 mL，輕微振蕩試管，使試管內溶液顏色均勻，將6個試管置于試管架中靜置10 min，靜置結束之后，輕微移動試管，防止再次產生振蕩，然后在490 nm處測吸光度[9]，記錄數(shù)值，繪制圖表。

1.3.4 樣品的測定

試驗得到的是澄清的黃色溶液，取試驗得到的樣液1 mL，溶解于500 mL蒸餾水中，再取稀釋后的溶液1 mL于試管中，加入6%苯酚溶液，同時加入5 mL濃硫酸，輕微振蕩試管，使試管內溶液顏色一致，然后放置于試管架中靜置10 min，同時配制好空白試驗，靜置結束后在490 nm處測吸光度，記錄數(shù)值，若數(shù)值偏高，或直接在溶液反應時已覺察在試管中的液體顏色較深，可重新取樣液，并提高稀釋倍數(shù)，并重新測量，每次測定應做3組重復試驗。

1.3.5 計算多糖得率

多糖得率=(a·b/c)×100%。

式中：a為利用標準曲線求得的葡萄糖質量(μg)，b為浸提處理液的稀釋倍數(shù)，c為稱取的豆粕質量(μg)。

1.4 單因素試驗的操作步驟

1.4.1 料液比的選擇

分別取5個錐形瓶，編號1～5號，分別加入10 g豆粕粉，再加入豆粕粉質量1.0%的纖維素酶，然后分別加入100，150，200，250，300 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌充分混合。之后調節(jié)pH為5.0，然后放于60 ℃的水浴鍋中浸提90 min，水浴鍋中的頁面應超過錐形瓶中的液面，每個錐形瓶用棉塞封口，并且水浴鍋應加蓋，時間計時從溫度穩(wěn)定開始，在浸提過程中應每隔一段時間搖勻錐形瓶，充分提取豆粕中的多糖。反應結束后，取出錐形瓶靜置一段時間，使不溶解的部分沉于瓶底，轉移至離心管時，輕微傾斜至錐形瓶中只剩下不溶解成分，之后在3500 r/min的條件下離心10 min，取出后轉移上清液至燒杯中，調節(jié)pH至4.5，使蛋白質完全沉淀，在上述條件下再次離心，如若得出的溶液仍有白色絮狀物存在，應再次調節(jié)pH，并重新在相同條件下離心，此時得到的上清液為可溶性大豆多糖的水溶液，進行多糖得率的測定，記錄數(shù)值。

1.4.2 酶添加量的選擇

纖維素酶添加萬分之一即可起作用，所以在這個基礎上選擇單因素。分別取5個錐形瓶，編號1～5號，各加入10 g豆粕粉，然后分別加入0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%豆粕粉質量的纖維素酶，各加入200 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌充分混合，調節(jié)pH為5.0。然后在60 ℃的條件下水浴浸提90 min，浸提結束后將三角瓶中的溶解部分在3500 r/min的條件下離心10 min，取出后轉移上清液到燒杯中調節(jié)pH至4.5，沉淀豆粕中的蛋白，在相同條件下再次離心，如若得到的溶液不是非常澄清、有絮狀物，重復交接pH的步驟，最后得到的澄清液為豆粕多糖的水溶液，進行多糖得率的測定，記錄數(shù)值。

1.4.3 酶解pH的選擇

在編號1～5號的錐形瓶中加入10 g豆粕粉，再加入豆粕粉質量1.0%的纖維素酶，之后加入200 mL蒸餾水，攪拌充分混合，按從小到大的順序依次調節(jié)pH為3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，放于60 ℃的水浴鍋中浸提90 min，水浴鍋液面超過錐形瓶液面，并且水浴鍋加蓋。浸提結束后，調節(jié)離心機的轉速為3500 r/min，將錐形瓶中溶解部分離心10 min，之后將離心澄清的溶液轉移到燒杯中，調節(jié)pH至4.5，初始pH條件為4.5的3號管也應重新調節(jié)pH，使蛋白質完全沉淀，在相同條件下再次離心，如若仍有絮狀物出現(xiàn)在離心管中，應重復調節(jié)pH的步驟，最終得到的澄清溶液為豆粕多糖的水溶液，按照樣品的測定步驟進行多糖得率的測定，記錄吸光度值。

1.4.4 酶解時間的選擇

在編號1～5號的錐形瓶中加入10 g豆粕粉，再加入豆粕粉質量1.0%的纖維素酶，之后加入200 mL水，攪拌充分混合，調節(jié)pH為5.0，在60 ℃的溫度條件下進行水浴浸提，浸提時間按從小到大的順序依次為30，60，90，120，150 min，浸提結束后，調節(jié)離心機的轉速為3500 r/min，將溶解部分離心10 min，結束后轉移上清液至5個燒杯中調節(jié)pH至4.5，使蛋白質完全沉淀，然后在相同條件下再次離心，如若仍有白色絮狀物出現(xiàn)，重復調節(jié)pH的步驟，最后得到的澄清液為豆粕多糖的水溶液，按照樣品測定的步驟進行多糖得率的測定，記錄吸光度值。

1.4.5 酶解溫度的選擇

在5個相同的錐形瓶中，加入10 g豆粕粉，加入豆粕粉質量1.0%的纖維素酶，再加入200 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌充分溶解，將錐形瓶編號1～5號，調節(jié)水浴鍋的溫度條件依次為50，60,70,80,90 ℃，同時按照從小到大的順序對豆粕進行浸提，浸提結束后，將溶解部分在3500 r/min的條件下離心10 min，離心結束后轉移上清液于燒杯中調節(jié)pH至4.5，使蛋白質完全沉淀，在相同條件下離心分離取上清液，如若仍有白色絮狀物出現(xiàn)，重復調節(jié)pH的步驟，最后得到的澄清液為豆粕多糖的水溶液，按照樣品測定的步驟進行多糖得率的測定，記錄吸光度值。

1.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗，選擇溫度、時間、pH值和添加量為4個因素，對應的3個提取率較高的試驗條件為水平進行正交試驗，因素與水平見表1。

表1 正交因素與水平

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 不同料液比對試驗結果的影響

圖2 不同料液比對試驗結果的影響

由圖2可知，料液比較優(yōu)水平為1∶20。

2.2.2 不同的酶添加量對試驗結果的影響

圖3 不同的酶添加量對試驗結果的影響

纖維素酶添加萬分之一即可起作用[10]，所以在這個基礎上選擇單因素。由圖3可知，多糖得率逐漸升高，在1.0%處達到多糖得率的最大值，繼續(xù)添加纖維素酶，可能會使纖維素酶分解溶解出的多糖，使部分多糖和糖苷遭到破壞，降低多糖得率，故選擇酶添加量為1.0%。

2.2.3 不同pH值對試驗結果的影響

圖4 不同pH值對試驗結果的影響

由圖4可知，纖維素酶發(fā)揮最大作用的pH值在4～6之間[11]，故選擇pH值為3.5～6.0的因素選擇。試驗結果依次為10.65%，12.25%，13.85%，14.49%，12.89%。在pH值為3.5時，酶未能發(fā)揮良好作用，多糖得率僅為10.65%，而從pH值為4開始，曲線呈明顯的上升趨勢，直至pH值為5附近時，到達頂點，而后隨著遠離最適條件，結果呈下降趨勢，但因試驗條件的限制，不能測得pH值為5.5的結果，但通過圖4仍可反映出適宜酶解pH值在5附近，故選擇酶解pH值為5.0。

2.2.4 不同的酶解時間對試驗結果的影響

為了體現(xiàn)出時間因素對試驗結果的影響，選擇了間距較寬的時間段，這可以反映出時間對結果影響的趨勢。

圖5 不同的酶解時間對試驗結果的影響

由圖5可知，在較短的時間里，酶不足以完全反應，多糖沒有完全溶解，反應進行到90 min乃至更久時，多糖得率已經趨于平衡，纖維素酶作用不再明顯。綜合考慮，選擇最佳酶解時間為90 min。

2.2.5 不同反應溫度對試驗結果的影響

圖6 不同反應溫度對試驗結果的影響

由圖6可知，纖維素酶的酶解溫度在50～70 ℃之間[12]。60 ℃時酶活性最高，在高溫時酶活力下降，會出現(xiàn)不可逆轉的特性，使得在90 ℃時，多糖得率比較低溫度時更低。

2.3 正交試驗結果與分析

表2 正交試驗結果

續(xù) 表

由表2可知，4個單因素對多糖得率的影響程度不同，從大到小依次為酶解溫度、pH值、酶解時間、酶添加量。正交試驗最佳試驗因素為A2B2C3D1。由于不同酶添加量對試驗的影響最小，而在單因素試驗中，1.0%的酶添加量效果優(yōu)于0.8%的酶添加量，而正交試驗沒有更優(yōu)的試驗條件，故應該選擇驗證試驗，試驗條件為酶解溫度60 ℃，酶解時間90 min，pH值5.0，酶添加量1.0%，試驗結果為14.92%，略高于優(yōu)選組合，則應該選擇驗證試驗的試驗條件為最佳條件。

3 結論

綜合單因素和正交試驗的結果，通過纖維素酶提取豆粕多糖的最適試驗條件為酶解溫度60 ℃，酶解時間90 min，pH值5.0，酶添加量1.0%，料液比為1∶20，多糖得率可以達到14.92%。本試驗通過對大豆生產的副產品豆粕的更加深層次的應用，為大豆多糖提取提供了更好的途徑。

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Study on the Enzymatic Extraction Process of Polysaccharides from Bean Pulp

FAN Wen-qi,YAO Zhi-hong,SHEN Li-yuan,NIE Xiang-zhen,LI Bo

(School of Tourism and Culinary Science, Yangzhou University, Yangzhou 225127,China)

Use cellulase to extract bean pulp polysaccharides, and then adopt phenol-sulfuric acid method to determine the content of bean pulp polysaccharides.Choose the ratio of solid to liquid, enzymatic temperature, enzymatic time, pH, cellulase amount as experimental conditions, and on the basis of single factor experiment, use orthogonal experiment to determine the optimum combination of factors. The experimental results show that the optimum experimental conditions for bean pulp polysaccharides are enzymatic reaction time of 90 min, enzymatic temperature of 60 ℃, pH of 5.0, cellulase amount of 1.0%, the ratio of solid to liquid of 1∶20, the polysaccharides extraction rate reaches 14.92%.Key words: extraction process; bean pulp polysaccharides; cellulase; phenol-sulfuric acid method

2016-11-14

范文奇(1994-)，男，山西晉城人，碩士，研究方向：食物成分與人體健康。

TS201.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.014

1000-9973(2017)05-0065-04