王欣，安燦，陳美齡，繆文華，羅成，鄧尚貴

(浙江海洋大學 食品與醫(yī)藥學院，浙江 舟山 316022)

酶水解哈氏仿對蝦蛋白提高咸味的研究

王欣，安燦，陳美齡，繆文華，羅成，鄧尚貴*

(浙江海洋大學 食品與醫(yī)藥學院，浙江 舟山 316022)

咸味是人類主要的味覺之一，是控制機體生理平衡最重要的因素之一。然而由于味覺的需要，人類食用鹽量普遍高于真正所需的量。為了研究水解海洋蛋白產生咸味肽，以便于開發(fā)適合于高血壓病人所需的無鈉調味劑。根據國標GB/T 12135-2008感官分析方法，該研究建立了NaCl感官評定標準曲線，以用于咸味肽對應食鹽濃度的感官評估。根據木瓜蛋白酶選擇性水解疏水氨基酸的特性，使用0.1%木瓜蛋白酶能使哈氏仿對蝦蛋白在0～2.5 h咸度從10 mmol/L提高到35 mmol/L，但仍保留多數哈氏仿對蝦20 kDa主蛋白及以下的蛋白。為了提高蛋白水解度以及提高咸度的可能性，使用1%的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶，雙酶水解在0～2.5 h幾乎所有蛋白都被消化，咸度由10 mmol/L提高到55 mmol/L，這些實驗表明木瓜蛋白酶與中性蛋白酶一旦協(xié)同結合，既可充分地水解蛋白，也可釋放更多的咸味肽。而隨后咸味的下降應該是進一步水解成單氨酸，這些為咸味肽的工藝設計等提供了重要參考。

哈氏仿對蝦；感官評定標準；雙酶水解；咸味肽；木瓜蛋白酶；中性蛋白酶

食鹽(NaCl)所產生的咸味不僅可以改善人們的食欲，更重要的是，有調節(jié)人體機體體液和電解質平衡以及體溫的平衡等重要功能。然而據世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料，人類食用鹽普遍高于生理的實際需求。高鹽引起細胞及血管滲透作用異常，通常導致Ⅱ型糖尿病、高血壓及不同的心血管疾病[1,2]。為了保持同樣的食鹽咸度，而又能減少食用的食鹽量一直是食品科學的使命。目前世界衛(wèi)生組織(WHO)建議的鹽攝入量為6 g/天/成人(70 kg)， 但我國人群實際上的鹽攝入量超過10 g[3]，如北京地區(qū)人日均食鹽攝入量為16～18 g，高血壓發(fā)生率為9.5/萬人；而廣東地區(qū)人日均食鹽攝入量為6～7 g，高血壓發(fā)生率僅為2.5/萬人[4,5]。為了減少食鹽攝入量，最有效的方法是減少Na+的攝入，而又能保持食品咸味。目前我國市場上有各種各樣的低鈉 (比如KCl替代部分NaCl)調味劑，但或是缺乏營養(yǎng)，或實質上是堿性添加物。

當過量食鹽，血管中鹽濃度過高，血管中的水分就會增加，血容量增加，同時細胞內外鈉離子水平的增加可導致細胞水腫，血管平滑肌細胞腫脹，血管腔狹窄，外周血管阻力增大，進而導致血管壁受到的壓力增強，最終使血壓升高，此外，鹽也可加重心臟、腎臟的負擔，所有這些原因都可能使高鹽導致各種心血管疾病[6]。咸味肽最早是Tada等于1984年在對酪蛋白水解物BPla(Arg-G1y-Pro-Pro-Phe-lle-Val)的N端類似物的合成過程中偶然發(fā)現(xiàn)的。因為這些肽除了鮮味，也有咸味。接著他們又通過合成發(fā)現(xiàn)了幾種呈咸味的二肽，其中L-Orn-β-Ala. HCl和L-Orn-Tau. HCl有著與NaCl相同甚至比NaCl咸味更強的味[7]。Seki于1990年研究了咸味二肽Orn-β-Ala的理化性質，發(fā)現(xiàn)二肽的咸味與氨基的解離程度以及是否有相對離子有關。Seki等進一步研究認為多肽溶液的pH值與呈咸味的特性有很大關系[8]。

最近幾年從不同的蛋白酶水解短肽中發(fā)現(xiàn)，酶水解短肽，特別是魚精蛋白、奶蛋白，各種動物肉蛋白的咸味增加明顯，而大米、豌豆蛋白的水解肽幾乎不產生任何咸味[9]，主要是由于前者包含大量L-賴氨酸和L-精氨酸，雖然其機理尚不完全清楚，但這些短肽特別是二肽所提高的咸味不增加苦味，非常適合于糖尿病(Ⅱ型)人或高血壓病人提供高營養(yǎng)的無鈉咸味劑[10,11]。所以研究咸味肽，特別是從海洋漁業(yè)資源中尋找咸味肽，將有助于水產品的深加工。哈氏仿對蝦是舟山沿海重要的經濟蝦，價格低廉[12]，因而極有可能成為尋找咸味肽的良好材料。

1 材料與方法

1.1 材料

自然捕撈的哈氏仿對蝦[Parapenaeopsishardwickii(Miers)]：購買于舟山超市，由浙江海洋大學老師對哈氏仿對蝦進行鑒定；牡蠣蛋白肽：用作水解蛋白對照，青島東易科技發(fā)展有限公司；中性蛋白酶(EC 3.4.24.4)：50 U/mg，酶活≥50 U/mg，上海瑞永生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(EC 3.4.22.2)：級別為BR，酶活力為800000 U/g，上海研域生物工程有限公司；小牛血清白蛋白(BSA)：級別為BR，USA Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HZ-8812S-型電子恒溫振蕩器 常州諾基儀器有限公司；Bio-Rad 酶標儀 伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；Delta 320 pH 計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；DS-1 高速組織搗碎機 上海精密儀器儀表有限公司；HH-S 型水浴鍋，85-2 型恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；DHL-A 恒流泵，HD-3 紫外檢測儀，HD-A電腦采集器 上海瀘西分析儀器廠；AY120型分析天平；Himac CF 16RX離心機 日立公司。

1.3 方法

1.3.1 咸味感官標準曲線的制備

首先利用無離子水及58.5 g食鹽(浙江祿海制鹽有限公司)制備1 mol/L NaCl，然后稀釋配成10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100 mmol/L。對每種濃度根據國標GB/T 12135-2008感官分析方法：排序法及Friedman檢驗法進行評定[13]。即隨機利用連續(xù)3個濃度單盲正確地判斷出低、中、高濃度的測試者，測出其余的感官NaCl 濃度，并做出NaCl的感官標準曲線，用此曲線在測試人中形成自身的咸味刻度來測試未知咸度的對應食鹽濃度。

哈氏仿對蝦購買于舟山超市，酶解前保存于冰的環(huán)境。酶解條件：去離子水清洗后，經去殼、稱重100 g，按 1∶5的蛋白質量比加入0.01×PBS緩沖液，在DS-1高速組織搗碎機上打漿5～10 min，分別加入0.1%的木瓜蛋白酶、1%的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶，混合攪拌均勻，置于 50 ℃水浴鍋中，酶解過程中的pH不做調整(以防止引入鹽離子干擾咸度的鑒定)，酶解4 h；每0.5 h取樣1次，取樣后置于95 ℃水浴鍋中，滅酶15 min，冷卻，定容，12000 r/min離心10 min，取上清液備用。在水解過程中按設計的時間點進行取樣和感官評定。

1.3.2 蝦蛋白酶水解與咸度測定

哈氏仿對蝦經過勻漿后，以1∶5與0.01×PBS緩沖液稀釋，然后以蛋白樣品0.1%的木瓜蛋白酶，或者1%的木瓜蛋白酶與中性蛋白酶雙酶的酶量在50 ℃進行酶消化。對0.01%的木瓜蛋白酶酶解消化后，每30 min取樣1次，當場測量感官咸度，取得樣品用于SDS-PAGE樣品；對1%雙酶水解消化后，10 min 取樣1次，接下來每30 min取樣1次，當場測量感官咸度，取得樣品用于SDS-PAGE樣品。

1.3.3 Bradford 蛋白濃度測定

考馬斯亮藍G-250(1 g)，溶于50 mL 95%酒精，最后用無離子水定容到1000 mL。在96孔平板，按180 μL G-250+20 μL 設置，在595 mmol/L 波長使用Bio-Rad酶標儀測定其OD值。

1.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳

由于是2肽、3肽、寡肽，產生咸度更高，所以需展示可控的消化蛋白的變化過程。按照Bio-Rad方法配制5%的濃縮膠、15%的分離膠。SDS-PAGE凝膠電泳酶水解樣品，80 V，4 h。凝膠經過考馬斯亮藍R-250進行染色1 h后進行脫色，脫色約8 h后進行照相。利用Photoshop(Adobe 6.0)捕捉蛋白帶灰度值，并使用微軟Excel(2010專業(yè)版)計算出相對蛋白濃度。

1.3.5 數據與統(tǒng)計分析

每個實驗重復至少3次，實驗數據用x±s表示，采用t檢驗對各組變異性進行統(tǒng)計分析。以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。數據采用Excel(2010專業(yè)版)分析，做圖。

2 結果與分析

2.1 鹽咸度的感官評定曲線

由于缺乏真正的儀器測量咸度，故采用感官評價方法。根據文獻[9]，50 mmol/L的NaCl最接近肉湯的咸度。感官標準曲線感官濃度低于實際NaCl濃度 (R2=0.9921)，可能是溶解度帶來的誤差，也包括感官的不敏感帶來的系統(tǒng)誤差，見圖1。

圖1 食鹽(NaCl)感官曲線

注：誤差棒表示其標準誤差。

雖然檢測NaCl有專門的國標法 GB/T 12457-2008，但不可能用于非NaCl 咸味劑的測定，而只能有感官評定法。人的感覺器官是非常精密的“生物檢測器”，它可以檢測到用化學分析儀器無法檢測到的微量成分，測試人是在校大學生和研究生，其測試閾值是5～10 mmol/L NaCl。利用高、中、低的單盲測試結果，或作者通過自己建立起的記憶感官標準曲線，可相對精準地評定出對應的NaCl 濃度，這一標準曲線被始終用在這一研究中，以用作酶水解蛋白不同時間點對應的NaCl濃度與咸度的參照。

2.2 酶水解哈氏仿對蝦蛋白

酶水解前后總蛋白濃度變化利用考馬斯亮藍G-250在595 mmol/L對蛋白有吸收，蛋白標準曲線按照Bio-Rad公司提供方法進行，通過酶標儀的OD值及蛋白標準曲線換算出蛋白量。蛋白量從未消化時的0.92 mg/mL到3 h消化后的0.63 mg/mL，蛋白的降解趨于穩(wěn)定，0.1%木瓜蛋白酶水解的蛋白(總)濃度的變化進程見圖2，即蛋白濃度的變化會反映水解的程度。

圖2 Bradford 法測定木瓜蛋白酶水解(0.1%)前后蛋白濃度

2.3 SDS-PAGE檢測0.1%木瓜蛋白酶水解蛋白及咸味變化的感官評定

圖3 木瓜蛋白酶(0.1%)水解哈氏仿對蝦蛋白咸味的提高

注：A為SDS-PAGE 展示的 3 h的蛋白消化；帶1為蛋白標準；2為未經酶解的蛋白CK，3～8為0.1% 的木瓜蛋白酶水解的魚蛋白，依次為30'，60'，90'，120'，180' 的酶水解；B為對應的水解過程的咸味變化。

由圖3中A可知，0.1%的木瓜蛋白酶水解哈氏仿對蝦后的蛋白分布，大多數20 kDa位置的蛋白明顯未被水解，這個情況應該與木瓜蛋白酶的選擇性切割蛋白肽的特征有關系，木瓜蛋白酶選擇性切割疏水性氨基酸如賴氨酸、精氨酸等。由圖3中B可知，其咸度從10 mmol/L增加到2.5 h 的最高咸度35 mmol/L，隨后咸度下降，但沒有產生其他味道，一方面應該是酶量有限，不能水解更多的蛋白 (見圖3中A)，另一方面很有可能也受酶與蛋白的3D 空間影響，所以無3D 空間障礙的寡肽則會被繼續(xù)降解，所以造成咸度下降，這說明雖然木瓜蛋白酶的選擇性切割蛋白肽的特征導致水解不完全，但是其仍具有提高咸度的潛力。

2.4 SDS-PAGE 檢測雙酶水解蛋白及咸味變化的感官評定

圖4 木瓜蛋白酶與中性酶雙酶(1%)水解哈氏仿對蝦蛋白咸味的提高

注：A為SDS-PAGE 展示的10'～3 h的蛋白消化；帶1為蛋白標準；2為未經酶解的蛋白CK；3～9為1% 的雙酶水解的魚蛋白，依次為 10'，30'，60'，90'，120'，180' 的酶水解；B為水解過程的咸味變化。

由圖4中A可知，1%的中性蛋白酶與木瓜蛋白酶雙酶水解3 h可以基本全部消化哈氏仿對蝦的所有蛋白。由圖4中B可知，其咸度從10 mmol/L增加到2.5 h的最高咸度55 mmol/L，咸度增加幅度大，咸味明顯提升，在這個時間的咸味肽產生量最多，根據這一結果，我們可以選擇在酶解2.5 h時進行滅酶，然后分離提純，獲取最終的咸味肽。而隨后咸度下降，咸味中夾雜苦澀味和甜味以及鮮味等，中性蛋白酶的水解產生了苦味肽、甜味肽以及鮮味肽等，這有可能是中性酶水解蛋白導致單氨基酸所產生的原因。

3 結論

肽優(yōu)于蛋白質允許更快地與水吸附，咸味肽的發(fā)現(xiàn)有利于海洋水產品的深加工，提高經濟效益，更主要的是有助于降低NaCl的攝入量，向高血壓病人提供無鈉咸味劑，從而降低高血壓、Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的風險。

使用0.1%木瓜蛋白酶單酶水解咸度從10 mmol/L增加到35 mmol/L，這很有可能也受酶與蛋白的3D空間影響，從而無3D空間障礙的寡肽則會被繼續(xù)降解，從而造成咸度下降。而使用各自1%的木瓜蛋白酶及中性蛋白酶雙酶水解，咸度從10 mmol/L增加到 55 mmol/L，這應該由于結合了雙酶的優(yōu)勢，因為中性蛋白酶是隨機水解任何蛋白中的任何肽鍵，而木瓜蛋白酶則只選擇性地切割咸味相關的肽，這既幫助了蝦蛋白的加快水解，也保證精氨酸、賴氨酸二肽的形成，提高了更多咸味肽的產生，當然咸味肽需要有一定的二肽結構。隨著蛋白或者肽的深度酶解，二肽也將被水解成單氨基酸，這很可能是水解2.5 h后咸度反而下降的原因。

這些結果為有效地生產具有咸味的精氨酰二肽，在工業(yè)化過程中可能需要的消化及控制條件等的設計提供基本信息，以積累更多產品。

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[13]GB/T 12135-2008，感官分析方法：排序法[S].

Enzymatic Hydrolysis of Parapenaeopsis hardwickii(Miers) Protein for Enhancing Saltiness

WANG Xin, AN Can, CHEN Mei-ling, MIAO Wen-hua, LUO Cheng, DENG Shang-gui*

(School of Food and Medicine, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022,China)

Saltiness is one of the basic tastes and plays a key role in human physiological balance. The adverse effects of excessive salt intake have forced the food industry to seek alternatives to reduce salt content in food while maintaining sufficient saltiness. This study is to develop salty peptides from enzymatically hydrolyzed shrimp proteins, aiming for type 2 diabetes and high blood pressure patients. According to the standard GB/T 12135-2008 sensory evaluation method, a standard curve plotting salinity against salt (NaCl) concentration is established, which is used for the saltiness evaluation of fish peptides. Since papains selectively hydrolyze hydrophobic amino acids, such as arginine and lysine, and they are also amino acids for salty peptides. In this study, the protein ofParapenaeopsishardwickii(Miers) is digested by 0.1% papain(EC 3.4.22.2), the salinity increases from 10 mmol/L to 35 mmol/L, but 20 kDa and lower proteins remain. In order to improve the protein hydrolysis and the salinity, 1% neutral protease and papain, double enzyme hydrolysis for 2.5 h, almost all of these proteins can be digested, salinity increases from 10 mmol/L to 55 mmol/L. The experimental results show that papain and neutral protease is a synergistic combination, can be used to fully hydrolyze protein, and generate more salty peptide. The decrease of saltiness after the peak could be the results of further hydrolysis of dipeptides. These results provide an important reference for the process design of salty peptides in industry.

Parapenaeopsishardwickii(Miers); sensory evaluation standard; double enzymes hydrolysis; salty peptides; papain; neutral protease

2016-11-16 *通訊作者

國家自然科學基金重大項目(31471609)；中國國際科技合作計劃項目(2012DFA30600)

王欣(1991-)，女，江蘇徐州人，碩士，研究方向：食品科學與水產品加工；

羅成(1958-)，男，教授，博士，研究方向：食品科學；

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.004

1000-9973(2017)05-0012-05

鄧尚貴(1966-)，男，浙江舟山人，教授，博士，研究方向：食品科學與水產品加工。