毛和水 江文政 王野平 仇旭光

630～650nm可見光對小鼠創(chuàng)面愈合的影響研究

毛和水 江文政 王野平 仇旭光

目的 研究630～650nm可見光對小鼠創(chuàng)面愈合的影響，探討其調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制。方法 40只C57BL/6雄性小鼠以脊柱為對稱軸，在背部中間兩側(cè)對稱性制作直徑8mm的圓形全層皮膚缺損模型。小鼠左側(cè)創(chuàng)面設(shè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)組，右側(cè)創(chuàng)面設(shè)為對照側(cè)組。制模完成后實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面立即用630～650nm紅光治療儀照射，對照側(cè)組創(chuàng)面用LED臺燈照射。觀察并比較兩組創(chuàng)面不同時點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率；采用免疫組化方法檢測創(chuàng)面中性粒細(xì)胞（PMN）、巨噬細(xì)胞（Mφ）等炎性細(xì)胞的浸潤情況；采用ELISA法檢測創(chuàng)面TNF-α、IL-6的表達(dá)水平。 結(jié)果 制模后3、7、12d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面愈合率均高于對照側(cè)組（均P＜0.05）。制模后24h、3d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面PMN、Mφ浸潤均較對照側(cè)組減少（均P＜0.05）。制模后12、24h，3、7d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面IL-6、TNF-α表達(dá)水平均低于對照側(cè)組（均P＜0.05）。 結(jié)論 630～650nm可見光能適度減少小鼠創(chuàng)面炎性細(xì)胞的浸潤，抑制炎性因子分泌，在一定程度上降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，有效促進(jìn)急性創(chuàng)面的愈合。

630～650nm 可見光 弱激光治療 創(chuàng)面愈合 炎癥反應(yīng)

1967 年，Mester[1]在研究激光治療是否有致癌作用時意外發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的紅寶石激光（波長690nm）不僅無致癌作用，反而能促進(jìn)毛發(fā)生長。此后眾多學(xué)者對此進(jìn)行深入研究，并提出弱激光治療（LLLT）的概念，即波長在紅光至近紅外光之間（600～1 000nm），功率密度為0.001～5.000W/cm2的光照射生物組織所致的生物學(xué)效應(yīng)。LLLT過程中局部組織溫度不超過36.5℃或正常體溫，不會造成不可逆性損傷[2]，通過光調(diào)節(jié)細(xì)胞而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。基于此，本實(shí)驗(yàn)通過研究630～650nm可見光對小鼠創(chuàng)面愈合的影響，探討其調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)小鼠：清潔級C57BL/6雄性小鼠40只，體重18～22g，由南京大學(xué)模式動物研究所提供[動物許可證號：SYXK（蘇）2005-0004]。（2）主要藥物、試劑和儀器：S-P免疫組化試劑盒購自上海晶美生物技術(shù)有限公司?？笷4/80單克隆抗體、抗Myeloperoxidase單克隆抗體購自英國Abcam公司。檸檬酸緩沖液（pH 6.0）購自上海長島生物技術(shù)有限公司。IL-6酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購自美國R&D公司。5810R Centrifuge高速低溫水平離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。微量電動組織勻漿器購自美國KIMBLE公司。倒置熒光顯微鏡攝像系統(tǒng)購自日本Olympus公司。LED臺燈購自飛利浦照明投資有限公司，型號酷恩，功率3.6W。紅光治療儀購自深圳普門科技有限公司，型號c a r n a t i o n-6 6，波長（6 4 0±1 0）n m，輸出功率5 0 W。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和實(shí)驗(yàn)分組 3%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，麻醉滿意后，背部剃毛；用聚維酮碘消毒溶液消毒皮膚兩遍，以脊柱為對稱軸，在背部中間兩側(cè)對稱性制作直徑8mm的圓形全層皮膚缺損模型。制模完成后每只小鼠分籠飼養(yǎng)，創(chuàng)面每日拍照記錄及換藥1次。小鼠左側(cè)創(chuàng)面設(shè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)組，右側(cè)創(chuàng)面設(shè)為對照側(cè)組。制模完成后實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面立即用紅光治療儀照射，能量密度為5J/cm2，時間為200s，1次/d，照射過程中用錫紙遮蓋對照側(cè)組創(chuàng)面；對照側(cè)組創(chuàng)面用LED臺燈照射，能量密度為0J/cm2，時間為200s，1次/d，照射過程中用錫紙遮蓋實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面。制模后1、12、24h及3、7、12d各隨機(jī)選取4只小鼠，在距離創(chuàng)緣3mm的范圍內(nèi)切取標(biāo)本，一分為二，置于Eppondorf管中-80℃冰箱保存，其中1份采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6的表達(dá)，另1份用10%甲醛溶液固定，采用免疫組化方法檢測組織中性粒細(xì)胞（PMN）、巨噬細(xì)胞（Mφ）等炎性細(xì)胞的浸潤情況。

1.2.2 創(chuàng)面愈合情況評估 肉眼觀察到創(chuàng)面完全被上皮組織覆蓋即為創(chuàng)面愈合。兩組創(chuàng)面均于制模后第3、7、12d應(yīng)用Image-J分析數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像，并按以下公式計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.3 PMN、Mφ檢測 標(biāo)本常規(guī)制作石蠟包埋切片，切取厚度為5μm。經(jīng)免疫組化染色，檢測創(chuàng)面組織中PMN、Mφ的浸潤情況。PMN免疫組化染色：一抗為兔源性MPO多克隆抗體，細(xì)胞質(zhì)染色提示陽性。Mφ免疫組化染色：一抗為大鼠源性F4/80單克隆抗體，細(xì)胞質(zhì)染色提示陽性。光鏡下觀察兩組創(chuàng)面的炎癥細(xì)胞浸潤情況；400倍顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野行計算機(jī)圖像分析計數(shù)PMN、Mφ并取平均值。

1.2.4 TNF-α、IL-6檢測 采用ELISA法測定兩組創(chuàng)面不同時點(diǎn)TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)水平，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。預(yù)先包被的抗體為單克隆抗體，檢測相抗體為多克隆抗體，經(jīng)生物素標(biāo)記。組織勻漿，取上清液。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過PBS的徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNFα、IL-6呈正相關(guān)，隨后用酶標(biāo)儀在450nm測定吸光度值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，兩組比較采用配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)愈合情況比較 見圖1、表1。

圖1 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)愈合情況肉眼觀察比較

表1 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)愈合率比較（%）

由圖1可見，制模后3d開始，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面較對照側(cè)組創(chuàng)面干燥，創(chuàng)面上皮化明顯加快。由表1可見，制模后3、7、12d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面愈合率均高于對照側(cè)組（均P＜0.05）。

2.2 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)PMN、Mφ浸潤情況比較

2.2.1 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)PMN浸潤情況比較 見圖2、表2。

由圖2可見，制模后24h，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面PMN浸潤較對照側(cè)組減少。由表2可見，制模后1h，兩組創(chuàng)面PMN浸潤比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；制模后12h、24h、3d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面PMN浸潤均較對照側(cè)組減少（均P＜0.05）；制模后7、12d，兩組創(chuàng)面PMN浸潤比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

2.2.2 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)Mφ浸潤情況比較 見圖3、表3。

由圖3可見，制模后7d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面Mφ浸潤較對照側(cè)組減少。由表3可見，制模后1、12h，兩組創(chuàng)面Mφ浸潤比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）；制模后24h，3、7、12d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面Mφ浸潤均較對照側(cè)組減少（均P＜0.05）。

2.3 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較 見表4。

圖2 兩組創(chuàng)面制模后2 4 h P M N浸潤情況比較（a：實(shí)驗(yàn)側(cè)組；b：對照側(cè)組；免疫組化染色，×4 0 0）

圖3 兩組創(chuàng)面制模后7 d M φ浸潤情況比較（a：實(shí)驗(yàn)側(cè)組；b：對照側(cè)組；免疫組化染色，×4 0 0）

表2 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)P M N浸潤情況比較（個）

表3 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)M φ浸潤情況比較（個）

表4 兩組創(chuàng)面各時點(diǎn)I L-6、T N F-α表達(dá)水平比較

由表4可見，制模后1h，兩組創(chuàng)面IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）；制模后12、24h，3、7d，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面IL-6、TNF-α表達(dá)水平均低于對照側(cè)組（均P＜0.05）；制模后12d，兩組創(chuàng)面IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

3 討論

正常的創(chuàng)面愈合是復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，炎癥反應(yīng)從中扮演著重要角色。適度而有序的炎癥反應(yīng)能夠有效促進(jìn)愈合，不足或過激則會影響創(chuàng)面愈合[3]。目前LLLT主要應(yīng)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合及組織修復(fù)，緩解因急慢性疾病引起的炎癥、水腫、疼痛，以及治療其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病[4]。創(chuàng)面愈合是LLLT較早應(yīng)用的領(lǐng)域之一。實(shí)驗(yàn)研究證明，LLLT對創(chuàng)面愈合的各個環(huán)節(jié)均有作用[5]：它能促使炎性細(xì)胞向創(chuàng)面遷移，并增強(qiáng)其功能；能刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角蛋白形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞增殖；促進(jìn)膠原蛋白的合成和沉積，促進(jìn)血管新生，促進(jìn)組織重塑。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面在制模后3d愈合開始加速，傷后12d已全部愈合，而對照側(cè)組創(chuàng)面此時仍有部分未愈。這提示LLLT能有效促進(jìn)急性創(chuàng)面愈合。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在整個創(chuàng)面愈合過程中，尤其是在炎癥早期，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面PMN、Mφ浸潤均較對照側(cè)組減少；在各時點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)側(cè)組創(chuàng)面IL-6、TNF-α表達(dá)水平均低于對照側(cè)組。這表明LLLT在炎癥反應(yīng)階段能適度減少創(chuàng)面PMN、Mφ的浸潤，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。炎性細(xì)胞的的適時、適度浸潤，能夠啟動機(jī)體自我防御性保護(hù)機(jī)制，降解壞死組織和病原體，分泌某些細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α、生長因子等）。這些細(xì)胞因子既能促進(jìn)炎性細(xì)胞的趨化、浸潤又能促進(jìn)各類修復(fù)細(xì)胞增殖、分化，形成大量細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管，促進(jìn)上皮化。后期炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的下降避免了過度炎癥的不利影響，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。研究發(fā)現(xiàn)，LLLT通過調(diào)控NF-Kb信號通路，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和生長因子的合成、分泌，如減少炎性細(xì)胞的浸潤，減少IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌[6]；促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子等細(xì)胞/生長因子的生成和釋放[7]，而這些生長因子使得包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞等細(xì)胞增殖并促進(jìn)膠原蛋白的合成、血管新生、肉芽形成，從而加速創(chuàng)面愈合[8]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明630～650nm可見光能適度減少小鼠創(chuàng)面PMN、Mφ的浸潤，抑制IL-6、TNF-α等炎性因子分泌，在一定程度上降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，有效促進(jìn)急性創(chuàng)面的愈合。

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630-650nm visiblelightpromotesacutewound healing in mice

MAO Heshui,JIANG Wenzheng,WANG Yeping,etal.

Department of Burn and Plastic Surgery,Jinhua Central Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the effects of 630-650nm visible light on wound healing in mice. Methods The round full-thickness skin defects of 8mm diameter were symmetrically made in the back of 40 male C57BL/6 mice.The left side of the wound was exposed to 630-650nm visible lights immediately after modeling(study group)and the right side was treated with normal LED light(control group).The wound healing rate at different time points was observed and compared between two groups.The infiltrations of neutrophils(PMN)and macrophages(Mφ)were detected by immunohistochemical staining;and the expression of TNF-a and IL-6 was detected with ELISA. Results The wound healing rate at 3d,7d and 12d after modeling in study group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).The infiltration of PMN and Mφ was lower in study group than that in control group at 24h and 3d after the modeling (P＜0.05).The protein expression of IL-6 and TNF-α was lower in study group than that in control group at 12h,24h,3d and 7d after the modeling(P＜0.05). Conclusion 630～650nm visible light can promote the healing of acute wounds in mice,which is associated with the decreased infiltration of inflammatory cells and inhibiting the secretion of inflammatory factors.

630～650nm Visible lightLLLT Wound healing Inflammatory response

2 0 1 7-0 1-1 8）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2017- 140

321000金華市中心醫(yī)院燒傷整形皮膚外科

仇旭光，E- m ail：qw xg@ sohu.com