劉 鵬, 酈 楓, 曹 林, 吳玉環(huán),章 藝, 徐根娣, 馬 麗, 劉 丹

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036；3.浙江旅游職業(yè)學(xué)院，浙江 杭州 311231)

菊芋抗逆性評(píng)估及HtCPI基因的克隆與表達(dá)分析

劉 鵬1, 酈 楓1, 曹 林1, 吳玉環(huán)2,章 藝3, 徐根娣1, 馬 麗1, 劉 丹1

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036；3.浙江旅游職業(yè)學(xué)院，浙江 杭州 311231)

在逆境脅迫測(cè)試的基礎(chǔ)上，利用RT- PCR技術(shù)從菊芋葉片中克隆了半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因的完全開放閱讀框序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)和脅迫表達(dá)分析.結(jié)果表明:獲得的基因序列具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑特征性的結(jié)構(gòu)域，HtCPI由333 bp的核苷酸組成；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，HtCPI推定的HtCY蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，HtCY與山楊的CY蛋白相似性為96%，與姜黃的CY相似性為94%；經(jīng)氨基酸序列比對(duì)，推斷該蛋白有一個(gè)高度保守的QKVKQ結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的LAKFAVDHHN結(jié)構(gòu)域；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，HtCY可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上.組織特異性檢測(cè)表明，HtCPI在菊芋根、莖、葉中均有表達(dá)，在莖中的表達(dá)量最高.實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析表明，水楊酸、氯化鈉、氯化鋁和聚乙二醇等處理均能誘導(dǎo)菊芋根和葉中HtCPI基因表達(dá)上調(diào)；熒光定量分析顯示，雖然在不同的脅迫因子條件下其上調(diào)的程度有一定的差異，但均在4 h后表達(dá)量發(fā)生明顯的上升，即對(duì)水楊酸、氯化鈉、氯化鋁和聚乙二醇等處理均存在轉(zhuǎn)錄響應(yīng).推測(cè)該基因參與了菊芋對(duì)生物或非生物脅迫的防御機(jī)制.

菊芋；脅迫；半胱氨酸蛋白酶抑制劑;克?。槐磉_(dá)；基因

菊芋(Helianthustuberosus)為多年生草本植物，菊科向日葵屬，俗稱洋姜、鬼子姜，喜溫暖、耐嚴(yán)寒，喜濕潤、耐干旱，喜肥沃、耐鹽堿[1- 2]，在全球各個(gè)氣候帶均有分布及栽培.菊芋塊莖富含菊糖，可作為生產(chǎn)乙醇、生物發(fā)酵及油脂的良好來源；在藥用上，菊芋有利水除濕、清熱涼血及和中益味的功效，并具有特殊的保健和抗癌作用；其地上部分可作為家畜飼料[3].隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，利用菊芋生產(chǎn)生物質(zhì)能源的經(jīng)濟(jì)效益日益顯著.不同品種的菊芋對(duì)不同的逆境均表現(xiàn)出不同的響應(yīng).

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cysteine proteinase inhibitor，CPI)，又被稱為巰基蛋白酶抑制劑，可同半胱氨酸蛋白酶特異性結(jié)合，通過抑制酶活性來防止蛋白質(zhì)二硫鍵的破壞，保護(hù)相關(guān)蛋白不被降解，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的生命活動(dòng).植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因在水稻[4]、大麥[5]、小麥[6]、玉米[7]、擬南芥[8]、豌豆[9]和番茄[10]等植物中均已被鑒定出來.此類基因的表達(dá)受外源激素處理、機(jī)械損傷、溫度脅迫和酸堿鹽等脅迫處理所誘導(dǎo)，證明其與植物的防御機(jī)制相關(guān)[11- 13].雖然國內(nèi)外對(duì)于植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因已做過大量的研究，但此基因在菊芋中的脅迫表達(dá)還未見報(bào)道.本研究首次以菊芋(產(chǎn)自南京)幼苗為研究材料，克隆到一個(gè)編碼菊芋HtCY蛋白的基因，運(yùn)用生物學(xué)軟件對(duì)該HtCY蛋白序列進(jìn)行了分析，構(gòu)建了該蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析了各種脅迫下菊芋CPI基因的表達(dá)特性，定量分析了目的基因的表達(dá)量，以期為利用HtCPI基因培育具有優(yōu)良抗性的菊芋新種質(zhì)提供理論依據(jù).

表1 所用引物

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菊芋材料為“南京菊芋”，種植于浙江師范大學(xué)生物園試驗(yàn)地.采集新鮮幼嫩葉片，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 試劑及引物

實(shí)驗(yàn)用水楊酸(SA)，NaCl，AlCl3和聚乙二醇(PEG)購自金華醫(yī)藥公司；大腸桿菌菌株DH5α購自TransGen公司；pMD18- T載體和熒光定量試劑SYBR Premix EX Taq均購自TaKaRa公司；Taq酶及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為Fermentas公司產(chǎn)品；dNTPs購自生工生物工程(上海)股份有限公司；凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品.其他均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?

實(shí)驗(yàn)所用引物(見表1)合成及測(cè)序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成.所用引物均根據(jù)GeneBank中登錄號(hào)為JX134892的基因組序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)獲得.

1.3 脅迫處理

菊芋幼苗長到4片真葉后，選取長勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行脅迫處理：水楊酸脅迫(50 μmol/L SA)、干旱脅迫(20% PEG- 6000)、鹽脅迫(500 μmol/L NaCl)和鋁脅迫(500 μmol/L AlCl3)，并做空白對(duì)照.處理時(shí)間分別為3，6，12，24和48 h.取根和葉片作為樣品，迅速保存于液氮中.每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù).

1.4 SOD,POD和CAT活性及MDA含量測(cè)定及分析

過氧化物酶(POD)活性選擇愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)活性選擇氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法測(cè)定；過氧化氫酶(CAT)活性用紫外吸收法測(cè)定；丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定[14].首先計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以單因素方差分析法和Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析，用Origin軟件制圖.

1.5 總RNA的提取和cDNA合成

所有與提取相關(guān)的玻璃、塑料等制品均經(jīng)0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液浸泡過夜處理.菊芋幼苗總RNA用RNeasy Plant Mini Kit(74903)試劑盒步驟抽提，抽提的RNA用50 μL無RNA酶的水(RNase- Free WATER)洗脫，用超微量分光光度計(jì)(Nano DROP)檢測(cè).取2 μg的總RNA，以O(shè)logo(dT)為引物，利用試劑盒合成cDNA的第一條鏈.

1.6HtCPI的cDNA克隆與生物信息學(xué)分析

以cDNA第一鏈為模板，借助已構(gòu)建的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段連接到pmd18- T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109.在Amp抗性平板上篩選陽性單克隆抗體，經(jīng)過質(zhì)粒PCR或酶切鑒定得到重組克隆.最后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證(上海捷蘭生物技術(shù)有限公司).

用ProtPara(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和理論等電點(diǎn)；使用ExPASy在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)和分析基因編碼的產(chǎn)物；借助TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/)分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析；用WOLFPSORT(http://wolfpsort.org/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè).蛋白質(zhì)同源性對(duì)比分析采用Clustal X2.0和GenDoc軟件；利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.數(shù)據(jù)資料來源于NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫.

1.7HtCPI熒光定量PCR表達(dá)分析

參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Perfect Real- time)的操作說明書進(jìn)行熒光定量PCR分析(引物序列見表1).以向日葵ACT1基因作為內(nèi)參基因，對(duì)HtCPI基因在不同組織的表達(dá)情況進(jìn)行熒光定量分析.對(duì)鋁脅迫和其他3種脅迫(水楊酸、NaCl、PEG)下HtCPI基因的表達(dá),以高等植物中非常保守的內(nèi)參基因ACT2進(jìn)行qRT- PCR.測(cè)量均進(jìn)行3次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線，相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法[15]，繪圖并計(jì)算3次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤.

2 結(jié)果與分析

圖1 脅迫條件對(duì)菊芋葉片MDA含量的影響

2.1 菊芋葉片丙二醛含量分析

植物體內(nèi)存在的活性氧在其代謝中具有一定的信號(hào)調(diào)節(jié)作用，正常情況下由于活性氧系統(tǒng)反饋機(jī)制而處于平衡狀態(tài)，并不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生損傷.而當(dāng)其受高溫等逆境脅迫時(shí)，活性氧水平超過機(jī)體承受能力而導(dǎo)致膜脂過氧化，開始對(duì)植物生理代謝產(chǎn)生影響，在此過程中丙二醛含量會(huì)伴隨上升.因此，可通過丙二醛含量的高低來比較植物受脅迫的程度.如圖1所示，菊芋葉片丙二醛含量在5種脅迫處理下與對(duì)照相比均有顯著的上升.其中，鋁處理組在各處理組中增幅最高，達(dá)21.47%.由此反映出，在鋁脅迫下菊芋葉片膜脂過氧化程度較重，丙二醛含量較高.

2.2 菊芋葉片SOD，POD和CAT活性分析

圖2 脅迫條件對(duì)菊芋葉片SOD，POD和CAT活性的影響

植物體內(nèi)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等在內(nèi)的酶先后按一定次序和比例共同構(gòu)成了酶促活性氧清除體系[16].通過比較各組酶活性的值，發(fā)現(xiàn)菊芋葉片在鋁處理下能適應(yīng)性地激活SOD的活性，其他酶活性在整體水平上均明顯高于對(duì)照處理，但變化趨勢(shì)各異.如圖2所示：在水楊酸處理下，POD活性變化趨勢(shì)與SOD活性變化相似；而干旱處理明顯對(duì)其酶系統(tǒng)的損傷最大，表現(xiàn)在其對(duì)3種酶活性的抑制程度與其他組相比較高，如其POD活性與對(duì)照組相比減少了16.67%，而其CAT活性則只達(dá)到對(duì)照組的22.45%.從以上結(jié)果可以看出，脅迫處理會(huì)誘導(dǎo)菊芋葉片CAT等酶活性升高，但不同的處理下增量不同，綜合分析后顯示了菊芋葉片SOD活性較強(qiáng).

2.3HtCPI基因的克隆及生物信息學(xué)分析

2.3.1HtCPI全長cDNA克隆與序列分析

利用BioEdit軟件和NCBI網(wǎng)站對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，克隆得到的序列與數(shù)據(jù)庫中菊芋基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)序列完全一致.序列分析表明，HtCPI基因的ORF(open reading frame)全長333 bp，編碼111個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為11.8 kDa，理論等電點(diǎn)為8.99.該蛋白質(zhì)由18種氨基酸組成，其中亮氨酸(leu)含量最為豐富，蛋氨酸(met)含量最少，負(fù)電荷殘基(天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu))6個(gè)，正電荷殘基(精氨酸(Arg)，組氨酸(His)，賴氨酸(Lys))10個(gè).二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白α螺旋占29%，β折疊占30%，其余41%屬于轉(zhuǎn)角，是混合型二級(jí)結(jié)構(gòu)，氨基酸之間存在二硫鍵.螺旋結(jié)構(gòu)與卷曲結(jié)構(gòu)散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中，構(gòu)成菊芋半胱氨酸蛋白酶抑制劑二級(jí)結(jié)構(gòu)的骨架.通過SMARTF分析，第38～107位存在半胱氨酸蛋白酶抑制劑樣結(jié)構(gòu)域，帶單一的結(jié)構(gòu)蛋白，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族Ⅰ的成員.

圖3 HtCPI cDNA及編碼蛋白序列

2.3.2 HtCPI蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及功能分析

以SignalP對(duì)HtCPI蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在其氨基酸序列中含有一個(gè)由20個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽.用來自不同物種的5種半胱氨酸抑制劑蛋白進(jìn)行序列對(duì)比分析，可以得出，菊芋半胱氨酸抑制劑蛋白(HtCY)在N末端附近均具有保守的GG殘基，在氨基酸序列內(nèi)部具有一個(gè)高度保守的QKVKQ(見圖3)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的LAKFAVDHHN結(jié)構(gòu)域.應(yīng)用TMHMM Server對(duì)HtCY進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，此蛋白存在一個(gè)從7～29氨基酸的跨膜螺旋區(qū)域結(jié)構(gòu)域.跨膜結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜中起著固系作用，一般富含疏水性氨基酸殘基，屬于跨膜蛋白類.蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明：HtCY定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率為33%，可能性最大；定位于細(xì)胞線粒體和液泡的概率均為22%.據(jù)此推測(cè)HtCY為網(wǎng)膜蛋白.利

表2 菊芋HtCPI基因功能預(yù)測(cè)

用PlantCARE在線預(yù)測(cè)HtCPI啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，在此區(qū)間預(yù)測(cè)到多種順式作用元件(見表2)，包括對(duì)光、激素、脅迫、代謝調(diào)節(jié)及器官發(fā)育等的響應(yīng)元件.通過Protfun軟件預(yù)測(cè)HtCPI基因編碼產(chǎn)物的功能，從表2可知：該蛋白具有類似動(dòng)物中生長因子(growth factor)的功能，可能性0.040；預(yù)測(cè)也存在其他功能，如存在比較強(qiáng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可能性為0.272.由此推斷，HtCPI基因可能在菊芋的生長發(fā)育和抗逆性中發(fā)揮重要作用.

2.3.3 HtCY蛋白結(jié)構(gòu)域與同源性分析

通過NCBI提供的BlastP進(jìn)行序列分析.HtCY氨基酸序列經(jīng)BLASTP檢索得出：與楊樹的半胱氨酸蛋白抑制酶序列一致性較高，與山楊的一致性為96%；與姜黃、甘薯和康乃馨序列的同源性都在90%以上，分別為94%，92%和90%.由此得出，HtCY有多個(gè)保守的氨基酸序列(見圖4).用MAGE軟件對(duì)菊芋半胱氨酸蛋白酶抑制劑(HtCY)與不同物種中不同類型的半胱氨酸抑制蛋白系統(tǒng)進(jìn)行分析表明，其系統(tǒng)進(jìn)化樹包含2個(gè)分支，分別為蛋白質(zhì)半胱氨酸抑制劑家族Ⅰ和家族Ⅱ(見圖5).可以看出，菊芋HtCY蛋白的進(jìn)化與其他植物的進(jìn)化基本一致，同科植物在進(jìn)化樹上處于同一分支.并且，發(fā)現(xiàn)菊芋與咖啡樹、獼猴桃的親緣關(guān)系較近.

圖4 菊芋和其他物種CPI氨基酸序列分析

圖5 不同物種間Cystain系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 HtCPI在菊芋不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.4HtCPI基因的表達(dá)分析

2.4.1HtCPI基因的組織特異性表達(dá)

以菊芋幼苗7 d后的根、7 d苗齡階段的莖尖分生組織、14 d苗齡的莖和第一個(gè)復(fù)葉、盛花期的花瓣和胚珠的RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行HtCPI基因的組織特異性表達(dá)分析.熒光定量PCR結(jié)果(見圖6)顯示：HtCPI基因在上述6種組織中均有表達(dá)，表達(dá)量存在明顯的差異；以菊芋根中的表達(dá)量作為空白對(duì)照，莖中的表達(dá)量明顯高于其他組織，而且在莖中的表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度比其在葉子、花和根中的值高出1.5～4.0倍，說明菊芋CPI基因在莖中特異性高水平表達(dá).

2.4.2HtCPI在不同脅迫處理下的熒光定量分析

為研究HtCPI基因在非生物脅迫下的功能，對(duì)NaCl，PEG，AlCl3和水楊酸處理下該基因在菊芋中的表達(dá)進(jìn)行了熒光定量分析.由圖7可以得出，以各時(shí)間點(diǎn)的未處理樣品為對(duì)照的前提下，HtCPI基因?qū)?種脅迫均有不同程度的響應(yīng).在NaCl處理的菊芋根和葉中，HtCPI基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為先上升后下降，在葉中12 h時(shí)出現(xiàn)峰值(鹽脅迫下葉中的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的10倍左右)，在根中24 h時(shí)出現(xiàn)峰值，此時(shí)鹽處理根中的相對(duì)表達(dá)量大概是對(duì)照的5倍左右，此后表達(dá)量又迅速恢復(fù)到6 h和12 h時(shí)的表達(dá)水平(見圖7(a)).在PEG處理下，根和葉中HtCPI基因表現(xiàn)為隨時(shí)間的增加表達(dá)量遞增的趨勢(shì)，均在24 h時(shí)出現(xiàn)各自的表達(dá)量高峰，隨后恢復(fù)到12 h時(shí)的表達(dá)水平(見圖7(b)).AlCl3脅迫的葉中HtCPI基因的表達(dá)模式與NaCl脅迫相類似，均呈先迅速上升后緩慢下降的趨勢(shì)，葉中相對(duì)表達(dá)量在12 h和24 h時(shí)上升至最大，隨后維持在較低的表達(dá)水平上但均高于對(duì)照組(見圖7(c)).水楊酸處理后，葉中HtCPI基因表達(dá)量在6 h時(shí)升至最大，隨后顯著降低；而根中HtCPI表達(dá)量快速增長至3 h后增長速率緩慢，12 h時(shí)達(dá)到最大值(見圖7(d)).NaCl，PEG，AlCl3和水楊酸4種處理下，HtCPI在葉中的最高表達(dá)量都明顯大于在根中的表達(dá)量.而水楊酸處理相較于其他脅迫處理下HtCPI的表達(dá)量均最小，由此推斷水楊酸本身可能對(duì)逆境脅迫有一定的緩解作用.上述結(jié)果表明，HtCPI基因參與了菊芋對(duì)非生物脅迫的防御機(jī)制.

圖7 HtCPI在不同處理下菊芋葉和根中的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

菊芋在水楊酸、干旱、鋁和氯化鈉等脅迫條件下的丙二醛含量表明，菊芋在鋁處理(500 μmol/L AlCl3)條件下受到脅迫的程度最大.具體分析證明：菊芋葉片細(xì)胞防御體系可有效保護(hù)細(xì)胞不受損傷；中度及重度脅迫下丙二醛含量先升后降，反映了細(xì)胞抗氧化防御體系最終超負(fù)荷運(yùn)作及膜脂過氧化程度逐漸加劇的必然結(jié)果.反映鋁等脅迫處理對(duì)菊芋生長中的細(xì)胞抗氧化防御體系均有不同程度的限制影響，而只有鋁脅迫明顯破壞了其結(jié)構(gòu)體系，自由基的調(diào)控失衡，丙二醛含量較其他各處理組有顯著的提升.在此基礎(chǔ)上聯(lián)系菊芋葉片中各項(xiàng)抗氧化酶的指標(biāo)，推測(cè)菊芋在某些相關(guān)抗性位點(diǎn)上存在一定的特殊結(jié)構(gòu)，以特異性地調(diào)控酶系統(tǒng)產(chǎn)生抗逆境蛋白等途徑增強(qiáng)其對(duì)逆境的適應(yīng)性.

半胱氨酸蛋白酶抑制劑一般與半胱氨酸蛋白酶等形成特定結(jié)構(gòu)的緊密復(fù)合物，保護(hù)蛋白質(zhì)二硫鍵不受破壞，阻止相關(guān)蛋白質(zhì)降解來發(fā)揮作用，存在3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端、C端周圍區(qū)域和QXVXG的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域及位于C端的PW保守結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域組成楔形剛好嵌合于酶的活性部位，有利于其與酶結(jié)合發(fā)揮抑制效應(yīng).根據(jù)植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑序列的同源性關(guān)系和分子大小，將其分為3種類型：Ⅰ型，分子量16 kDa以下，一般無二硫鍵形成.本研究HtCPI屬于此類型.Ⅱ型，分子量23 kDa左右，擁有與Ⅰ型植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑共同的N端和C端的保守序列,有二硫鍵形成.Ⅲ型，分子量約為80 kDa.王宇光等[17]成功構(gòu)建了甜菜M14品系半胱氨酸抑制劑基因的蛋白表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至煙草中，獲得了陽性轉(zhuǎn)基因煙草，為煙草抗病蟲害研究和基因功能的后續(xù)研究提供了廣泛前景.另外，也有研究從無核荔枝敗育胚珠中分離得到半胱氨酸抑制劑基因(LcCPI)，發(fā)現(xiàn)該基因具有半胱氨酸抑制劑保守區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)該基因與多個(gè)物種基因有很高的同源性，后續(xù)研究表明該基因?qū)τ谥参锓N子形成及胚胎發(fā)育有重要的作用[18].因此，很有可能HtCPI基因在參與菊芋對(duì)逆境響應(yīng)中起到關(guān)鍵性作用.

目前已有的研究主要集中在利用半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因提高植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性方面，但對(duì)其應(yīng)答機(jī)理沒有具體闡明.關(guān)于菊芋半胱氨酸抑制劑基因的分離、鑒定及調(diào)控還未見報(bào)道.本研究采用生物信息學(xué)軟件和在線分析工具對(duì)HtCPI基因及其編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明:HtCPI基因編碼111個(gè)氨基酸，整條多肽鏈總體上表現(xiàn)為親水性;其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的可溶性蛋白，具有N末端信號(hào)肽序列.系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，不同植物的HtCPI基因編碼的蛋白具有較高的相似性，菊芋和咖啡樹、獼猴桃等植物的HtCPI蛋白在進(jìn)化過程的親緣關(guān)系最近，說明該同源蛋白的功能較為相似.同時(shí)，反映了不同物種Cystain蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可能在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要的作用.

利用半定量RT- PCR對(duì)HtCPI基因在菊芋根、莖、葉、花、胚珠和莖尖分生組織的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，表明該基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，在莖中表達(dá)量相對(duì)較高，在根中的表達(dá)量最低.這個(gè)結(jié)果與黎科植物籽粒莧(Amaranthushypochondriacus)中半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因(AhCPI)在各組織的表達(dá)情況相似[19].為進(jìn)一步研究HtCPI基因在非生物脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)模式，對(duì)菊芋進(jìn)行了NaCl，PEG，AlCl3和水楊酸4種脅迫處理，菊芋葉和根中HtCPI基因的表達(dá)均受到這4種脅迫的誘導(dǎo)，且葉子中的表達(dá)量均高于根中.另外，水楊酸脅迫下HtCPI基因的表達(dá)量最小，可能是水楊酸本身就對(duì)脅迫有一定的緩解作用.有研究證明水楊酸可以作為一種中間介質(zhì)，當(dāng)植物受到生物脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生類似于水楊酸一樣的信號(hào)物質(zhì)，此介質(zhì)可以誘導(dǎo)板栗和馬鈴薯CPI基因的積累，增強(qiáng)植株對(duì)脅迫的抗性[20].

本研究利用RT- PCR進(jìn)行基因表達(dá)定量，結(jié)果顯示，HtCPI基因受干旱、水楊酸、鹽害及鋁脅迫等的誘導(dǎo)表達(dá)，表明HtCPI可能參與了菊芋對(duì)這類脅迫所共有的交叉響應(yīng)機(jī)制.進(jìn)一步研究HtCPI基因的功能還需要構(gòu)建植物表達(dá)載體，分析轉(zhuǎn)化到模式植物中過表達(dá)或者沉默的HtCPI基因的植物.本實(shí)驗(yàn)成果拓展了HtCPI功能研究的思路，為利用HtCPI基因培育具有優(yōu)良抗性的菊芋新種質(zhì)提供了理論支持，為提高菊芋產(chǎn)量提供了科學(xué)的實(shí)踐依據(jù).

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

Cloning and expression analysis ofHtCPIgene with the evaluation of the stress resistance inHelianthustuberosus

LIU Peng1, LI Feng1, CAO Lin1, WU Yuhuang2,ZAHNG Yi3, XU Gendi1, MA Li1, LIU Dan1

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China; 2.CollegeofBiologicalandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310036,China; 3.TourismCollegeofZhejiang,Hangzhou311231,China)

On the basis of the stress test, the open reading frame ofCPI(Cysteine proteinase inhibitor) gene was cloned fromHelianthustuberosusleafs with RT- PCR, for bioinformatics and stress expression analysis. The results showed that the sequence obtained had a protein domain with the characteristics ofCPI, contributed by 333 bp nucleotides. Prediction of protein structure indicated that, HtCY protein encoded by HtCPI had transmembrane domain and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that, HtCY had similarity of 96% with CY of aspen, and had similarity of 94% with CY of turmeric; by the comparison between sequences of the amino acids, it was inferred that the protein had a highly conserved domain named QKVKQ and a conservative domain named LAKFAVDHHN. POST results showed that, HtCY might be located in the endoplasmic reticulum. Tissue- specific analysis showed that,HtCPIcould be found in roots, stems, leaves, which had the highest expression in the stem. Real- Time PCR analysis showed that salicylic acid (SA), sodium chloride (NaCl), aluminum chloride (AlCl3), polyethylene glycol (PEG) and other treatments could improve the expression ofHtCPIregulated gene fromHelianthustuberosusroot and leaves, fluorescence quantitative analysis showed that although there were some differences between different groups on the degree, but all of them increased significantly after 4 hours. SA, NaCl, AlCl3, PEG and other treatments could motivate the transcriptional response of the gene, suggesting that the gene involved in the defense ofHelianthustuberosusto biotic and abiotic stress, for the foundation of further study of CPI in plant physiological functions.

Helianthustuberosus; stress; CPI; cloning; expression; gene

2016- 05- 04；

2016- 09- 26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41571049;41461010);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(5100390)

劉 鵬(1965-),男,湖南冷水江人,教授,博士.研究方向：植物生理生態(tài)研究;植物逆境生理;環(huán)境污染與保護(hù).

S567.23

A

1001- 5051(2017)02- 0188- 08