李原野，李鳳琴＊，徐志文，朱 玲

(1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)院，四川 西昌 615000，2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

一例豬藍(lán)耳病的實(shí)驗(yàn)室診斷及NSP2、ORF5基因序列分析

李原野1，李鳳琴1＊，徐志文2，朱 玲2

(1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)院，四川 西昌 615000，2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

為診斷四川眉山某豬場(chǎng)暴發(fā)的疑似豬藍(lán)耳病。利用RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行分子診斷，在確認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果的基礎(chǔ)上針對(duì)PRRSV的ORF5和Nsp2基因分別設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增基因片段進(jìn)行測(cè)序然后對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，該疫情由PRRSV引起，遺傳進(jìn)化分析表明該P(yáng)PRSV毒株的ORF5和Nsp2無(wú)明顯變異，現(xiàn)有防控措施有效。

豬繁殖與呼吸綜合征；ORF5；Nsp2；RT-PCR診斷

豬藍(lán)耳病亦稱(chēng)豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬繁殖障礙和呼吸道傳染病，臨床主要表現(xiàn)為妊娠母豬繁殖障礙，妊娠母豬流產(chǎn)、弱胎、死胎、木乃伊胎[1]；仔豬主要表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎等癥狀[2]。本病于20世紀(jì)80年代在美國(guó)首次流行以來(lái)，迅速傳遍世界主要養(yǎng)豬國(guó)家，中國(guó)于1995年發(fā)現(xiàn)該病[3]，是威脅我國(guó)當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的主要疫病之一，加強(qiáng)該病的分析研究和綜合防控，對(duì)生豬生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展意義重大。2016年12月，四川眉山某豬場(chǎng)暴發(fā)疑似豬繁殖與呼吸綜合征疫情，發(fā)病豬呼吸困難，剖檢肺部病變明顯，送至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品采集

2016年12月，四川眉山某豬場(chǎng)發(fā)生疑似PRRS，主要表現(xiàn)為仔豬食欲減退、高熱，體溫41 ℃，輕微腹瀉以及嚴(yán)重的呼吸道癥狀，剖檢可見(jiàn)肺部間質(zhì)性肺炎，全身淋巴結(jié)輕度水腫。通過(guò)臨床特征和病理解剖初步判斷為PRRS。采集發(fā)病豬血清以及肺臟、淋巴結(jié)和脾臟等組織冷藏保存，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PRRSV的RT-PCR診斷。

1.2 主要儀器和材料

Mastercycler PCR 擴(kuò)增儀（Eppendorf，德國(guó)）、Gel Doc 2000 凝膠圖像分析系統(tǒng)（BIO-RAD，美國(guó)）、2×Taq Plus PCR MasterMix（含染料）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TakaRaTaqDNA酶和DL 2 000 DNA Marker（寶生物工程大連有限公司）。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本實(shí)驗(yàn)所使用引物如表1所示，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR檢測(cè)及基因組序列擴(kuò)增所使用引物

1.4 病料處理及RNA的抽提

取采集病料0．5～2．0 g 研磨，并按1∶3 比例加入生理鹽水配成病料懸液，隨后反復(fù)凍融3次。凍融后按12 000 r/min 離心5 min 后取上清液，按照Trizol法提取RNA，并將提取的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法制成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-PCR檢測(cè)

取1μL cDNA于PCR管中，然后分別加入引物P1、P2和P3各10 pmol，2×PCR Master Mix 25μL，并補(bǔ)加無(wú)菌水至50μL，混勻后置PCR儀中按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃，1 min；95 ℃，5 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min； PCR結(jié)束后取5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

1.6 Nsp2和ORF5基因擴(kuò)增

以1．5反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別加入Nsp2-1、Nsp2-2引物和ORF5-1、ORF5-2引物，2×PCR Master Mix 25μL，并補(bǔ)加無(wú)菌水至50μL，擴(kuò)增Nsp2高變區(qū)和ORF5基因。

1.7 克隆與鑒定

PCR擴(kuò)增結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳、電壓100 V、30～50 min后觀察結(jié)果，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的基因片段，與pMD19-T Simple Vector載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（Amp+）中培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)NcoI、BamH I雙酶切及PCR鑒定，陽(yáng)性菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 序列測(cè)定及分析

將含目的DNA的陽(yáng)性菌液送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用DNAStar軟件（Version 7．0）對(duì)Nsp2基因、ORF5基因序列與GenBank中收錄的PRRSV的Nsp2基因、ORF5 基因序列的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用ClustalX、Mega 4．1 軟件繪制進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)待檢測(cè)樣品擴(kuò)增出一條180 bp的目的條帶（如圖1），而陰性對(duì)照樣品沒(méi)擴(kuò)增出條帶，此次發(fā)病豬為HP-PRRSV毒株感染。

2.2 Nsp2和ORF5基因片段的擴(kuò)增

圖1 病料檢測(cè)結(jié)果

Nsp2和ORF5基因擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果顯示Nsp2擴(kuò)增出一條約為1 100 bp大小的片段（如圖2A），而ORF5擴(kuò)增出一條約為564 bp大小的片段（如圖2B）。

2.3 序列測(cè)定結(jié)果

將連接質(zhì)粒測(cè)序后對(duì)序列進(jìn)行拼接，將此次測(cè)序毒株命名為PRRSV SC-2016株。結(jié)果顯示，Nsp2高變區(qū)序列長(zhǎng)度為1 103 bp，ORF5序列長(zhǎng)度為563 bp。分別將其與GenBank中收錄的PRRSV毒株相應(yīng)序列進(jìn)行Blast比對(duì)。通過(guò)臨近結(jié)合法（Neighbor-joining，NJ）分別構(gòu)建SC-2016毒株及參考毒株的Nsp2和 ORF5遺傳進(jìn)化樹(shù)，并且從遺傳進(jìn)化樹(shù)分支來(lái)看，SC-2016株屬Hp-PRRSV亞型。

2.4 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因序列分析

系列分析結(jié)果表明：SC-2016毒株的Nsp2與GenBank中14種參考毒株的同源性在68．0%-83．1%之間（見(jiàn)圖3），其中與北京株（2007-EU106888．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、廣東株（2007-EU880433．2）、甘肅株（2008-EU880437．2）、北京株（2006-EF112445．1）、武漢株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性在82．0%～83．1%之間。與北京株（2006-EF112445．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、甘肅株（2008-EU880437．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性最高，達(dá)82．9%～83．1%。

SC-2016毒株ORF5與GenBank中14種參考毒株的同源性在87．9%～99．8%之間（見(jiàn)圖4），其中與北京株（2007-EU106888．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、廣東株（2007-EU880433．2）、甘肅株（2008-EU880437．2）、武漢株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）、北京株（2006-EF112445．1）的同源性均在98%以上。與武漢株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性最高，達(dá)99．7%～99．8%。

2.5 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因遺傳發(fā)育樹(shù)分析

SC-2016毒株的的Nsp2和GenBank中收錄的14種代表毒株ORF5基因序列繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)與北京株（2006-EF112445．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、河北株（2012-JQ326271．1）關(guān)系較近（見(jiàn)圖5）。

圖4 ORF5基因同源性分析矩陣圖

圖5 Nsp2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

圖6 ORF5基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

SC-2016毒株的ORF5和GenBank中收錄的14種代表毒株ORF5基因序列繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)與河北毒株（2012-JQ326271．1）關(guān)系較近（見(jiàn)圖6）。

3 討論與分析

PRRS在20世紀(jì)80年代暴發(fā)以來(lái)，目前已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，給整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。主要引起母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎，斷奶仔豬生長(zhǎng)遲緩，且常常繼發(fā)其他病原感染。目前世界各國(guó)都在積極采取多種預(yù)防措施，但是該病在世界范圍內(nèi)仍陸續(xù)暴發(fā)，甚至出現(xiàn)了更多的高致病毒株系，PRRSV不同分離株核苷酸序列存在廣泛而明顯的變異，而不同毒株的 PRRSV具有不同的抗原性，從而造成本病更加難以控制[4-5]。PRRSV感染豬群后，其發(fā)病臨床特征和嚴(yán)重程度，取決于毒株、豬的年齡、繼發(fā)其他細(xì)菌或病毒的感染情況。PRRSV毒株的毒力越強(qiáng)、感染豬的日齡越小、存在其他病原混合感染時(shí)，臨床出現(xiàn)的病征就越嚴(yán)重，本場(chǎng)此次發(fā)生的PRRS疫情表現(xiàn)為發(fā)病豬臨床病征較嚴(yán)重，鑒定結(jié)果表明此次感染毒株為高致病性藍(lán)耳病毒株。

據(jù)資料表明，PRRSV通過(guò)堿基突變、缺失和基因重組發(fā)生變異，其中堿基突變最為多見(jiàn)[6]。高志強(qiáng)[7]等在2002年對(duì)HB-2(sh)毒株的全基因序列測(cè)定分析時(shí)首次發(fā)現(xiàn)PRRSV存在缺失變異現(xiàn)象，在NSP2和GP3基因上分別存在連續(xù)12個(gè)和1個(gè)氨基酸基因的缺失。越來(lái)越多的研究表明，PRRSV不同毒株的變異在整個(gè)基因組均有發(fā)生，但以Nsp2、ORF5變異程度最大[8-9]。因此，很多學(xué)者根據(jù)ORF5基因的變異情況研究病毒的遺傳演化規(guī)律。在所有結(jié)構(gòu)蛋白中，Nsp2為各毒株間差異較大的一個(gè)編碼區(qū)，變異程度最高，并具有種特異性，在各毒株間存在較大的差異，這也為主要毒株的新的分類(lèi)方法提供了依據(jù)。此次對(duì)PRRS SC-2016毒株分別將其與GenBank中收錄的PRRSV毒株相應(yīng)序列進(jìn)行Blast比對(duì)。并對(duì)SC-2016毒株及參考毒株分別構(gòu)建了Nsp2和ORF5的遺傳進(jìn)化樹(shù)。

根據(jù)遺傳分析結(jié)果可知，PRRSVSC-2016株的ORF5基因和Nsp2基因與2012年分離的河北毒株的親緣關(guān)系最近。從遺傳進(jìn)化樹(shù)分支來(lái)看，SC-2016株分屬Hp-PRRSV亞型，基因分析表明四川眉山株的PRRSV病毒的變異度不大，在其生物學(xué)特性以及細(xì)胞嗜性、致病力等方面變化都不大。同時(shí)通過(guò)進(jìn)化分析也發(fā)現(xiàn)，該病毒的序列略有變異，在日常防控工作中仍需加強(qiáng)PRRSV的監(jiān)測(cè)，做好該病的分子生物學(xué)調(diào)查，分析研究該病原變異的趨勢(shì)，對(duì)其致病機(jī)理和免疫機(jī)理進(jìn)行深入研究分析，更加有效的根據(jù)變異提供有效的疫苗，以更好的防控該病。

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2017-03-09)

四川省科技支撐計(jì)劃（2014NZ0043），國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2015BAD12B04-2.3）

李原野（1993-），女，四川人，在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)方向的研究

*通訊作者：李鳳琴，Tel：0835-2885846， E-mail： 410726908@ qq.com