（勃林格殷格翰國際貿(mào)易有限公司，北京 100027）

流行性2型PRRSV強(qiáng)毒株的廣譜中和抗體研究

陳 鍇，黃亞平（譯）；徐大為，朱連德（校）

（勃林格殷格翰國際貿(mào)易有限公司，北京 100027）

由于疫苗需要提供有效的交叉保護(hù)力對抗變異較大的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株，獲得可預(yù)測PRRSV免疫保護(hù)力的評估指標(biāo)可促進(jìn)群體管理改善和疫苗研發(fā)項(xiàng)目的開展。中和抗體在動(dòng)物和人的抗病毒免疫中起著關(guān)鍵作用，故通過特異性抗體中和病毒感染性的中和效力是免疫保護(hù)的常見預(yù)測因子。然而，由于病毒中和作用不是抗PRRSV免疫應(yīng)答的標(biāo)志性和共同特征，它們抗PRRSV的保護(hù)作用被打了折扣。例如，眾多關(guān)于生長豬的研究表明，PRRSV感染后數(shù)周至數(shù)月無中和抗體產(chǎn)生或以低于1/8滴度的低效價(jià)存在。目前，在PRRSV強(qiáng)毒暴發(fā)或有重復(fù)血清接種史的母豬群體中發(fā)現(xiàn)了具有廣譜反應(yīng)能力的高滴度中和抗體。進(jìn)一步的研究顯示，這些具有交叉反應(yīng)能力的中和抗體是所有受檢豬場母豬的共同特征，這些現(xiàn)象出現(xiàn)在免疫場或野毒感染場，與胎次無關(guān)，交叉反應(yīng)譜差異大，且在相同豬場的不同母豬個(gè)體中存在較大變化。例如，在一個(gè)常規(guī)接種疫苗豬場的所有母豬（N=20）均對VR2332具有同源血清中和活性，滴度范圍為15～256；90%的母豬對MN184具有滴度范圍為4～60的異源中和活性；20%的母豬對1型PRRSV SDEU具有滴度范圍為4～8的異源中和活性。在使用中和反應(yīng)檢測高毒力毒株P(guān)RRSV174時(shí)，發(fā)現(xiàn)其生長特征不同于所有其他病毒。在細(xì)胞系中加入相同拷貝RNA的情況下，使用TCID50檢測顯示毒株MW174的感染活性比其他毒株低約1 000倍。由于TCID50是基于細(xì)胞病變效應(yīng)，提示這種高毒力毒株家族可延遲或阻斷細(xì)胞裂解從而獲得更好的生長。來自兩個(gè)MW174毒株病毒暴發(fā)群體中的所有10頭母豬的血清均具有針對VR2332、MN184、MW174、NC134和1型SDEU的中和活性。在22%的樣品（N=50，每種病毒10個(gè)血清樣品）中和反應(yīng)滴度效價(jià)大于256，由于廣譜中和反應(yīng)血清可顯著降低異源PRRSV的感染，交叉抗體中和反應(yīng)活性非常重要。這些發(fā)現(xiàn)支持了PRRSV交叉保護(hù)的理論，表明免疫應(yīng)答相關(guān)的保守表位存在于1型和2型PRRSV毒株中。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

血清樣品收集于美國明尼蘇達(dá)州和北卡羅來納州的獨(dú)立商品代母豬群，這些種群被PRRSV毒株多次感染，感染途徑為疫苗免疫、自然感染或血清接種。血清樣品采集自：被多次不同毒力毒株感染的淘汰母豬、免疫過疫苗但未被強(qiáng)毒力毒株感染過的不同胎次母豬；使用強(qiáng)毒力PRRSV毒株對后備母豬進(jìn)行可控而系統(tǒng)性的馴化，實(shí)驗(yàn)性感染VR2332毒株后202 d，及來自具有較高病毒中和滴度的商品母豬群。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

通過灌洗各日齡動(dòng)物肺臟，但主要從5～6周齡保育豬收集豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）。 用含有50 μg/mL慶大霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行灌洗，并將紅細(xì)胞在無菌水中洗脫。使用70 μm過濾器過濾分離物，并重懸于采用40%RPMI培養(yǎng)基，50%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亞砜（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）配置的溶液中，冷凍保存。用RPMI培養(yǎng)基（CellgroMediatech，Manassas，VA）培養(yǎng)PAM，并添加丙酮酸鈉、硫酸慶大霉素、非必需氨基酸、HEPES緩沖液和5%FBS（Sigma，St．Louis，MO）。使用MEM培養(yǎng)基（Gibco，Grand Island NY）培養(yǎng)猿猴腎上皮MARC145細(xì)胞，并添加碳酸氫鈉、非必需氨基酸、HEPES緩沖液（Sigma，St．Louis，MO）、硫酸慶大霉素（CellgroMediatech，Manassas，CA）和10%FBS（Sigma，St．Louis，MO）。

3 PRRSV毒株

PRRSV分離株VR2332，MN184，SDEU，MW174，NC134接種并收獲于MARC145細(xì)胞，通過監(jiān)測96孔板中MARC145細(xì)胞的病變效應(yīng)，使用Reed＆Muench方法計(jì)算每個(gè)分離株的半數(shù)感染量（TCID50）。從兩個(gè)強(qiáng)毒力PRRSV流行毒株MN0111和MN1211上獲得了其ORF5的核苷酸序列信息（編碼糖蛋白5），但是并未分離到病毒。使用CLC Sequence Vie wer version 6．8．2（CLC bio/Qiagen，Cambridge，MA）對實(shí)驗(yàn)室改編毒株VR2332，疫苗株，MN184，1型PRRSV病毒 LelystadVirus (LV)株和1型田間分離株SDEU進(jìn)行序列比對分析，并在使用Geneious R6Tree Builder（Biomatters Ltd．，Auckland，New Zealand，版本6．1．7）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，bootstrap設(shè)置為100，不使用外參基因。同時(shí)使用Geneious R6分析不同毒株之間同源性差異百分比。

4 基于ELISA的血清中和抗體測定

以如下方法進(jìn)行PRRSV血清中和（SN）測定。將96孔板用25 μg/mL聚乙烯亞胺（Sigma-Aldrich，St．Louis，MO）處理，以6×104個(gè)細(xì)胞/孔接種PAM并培養(yǎng)48 h，或以6×103個(gè)細(xì)胞/孔接種MARC145細(xì)胞。將血清樣品熱滅活（56 ℃，30 min）并使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)稀釋。將稀釋后的血清與等體積的5×104TCID50/ mL PRRSV病毒在非貼壁96孔板中混合，并孵育1 h（37 ℃，5%CO2）。將含有5 000 TCID50的血清-病毒混合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞孔中，在37℃下吸附1 h。PBS洗滌細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，并進(jìn)一步溫育24～48 h。使用含有3．7%甲醛（Sigma-Aldrich，St．Louis，MO）的PBS固定，隨后洗滌，透化（PBS中的0．1%Triton X-100（Sigma-Aldrich，St。Louis，MO）），并封閉1 h（5%脫脂奶粉PBS）。使用含5%脫脂奶粉的PBS以1：10 000稀釋抗PRRSV核衣殼蛋白的單克隆抗體SR30-A（Rural Technologies，Brookings，SD），并以100 μL /孔加入細(xì)胞孔，孵育1 h。以100 μL/孔加入，以1：10 000稀釋羊抗鼠HRP（H+L），反應(yīng)1 h。加入100 μLTMB（KirkegaardPerry Laboratories，Gaithersburg，MD）過氧化物酶底物進(jìn)行顯色，作用15 min。最后用100μL的1M磷酸終止反應(yīng)，平板使用Millermax酶標(biāo)儀（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）于450nm進(jìn)行讀數(shù)。在每個(gè)稀釋度下的病毒抑制比例與扣除空白背景吸光度的陽性病毒感染對照進(jìn)行對比。計(jì)算出能保護(hù)50%細(xì)胞孔不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價(jià)。

5 結(jié)果與討論

通常認(rèn)為，PRRSV感染后體液免疫應(yīng)答較弱，中和抗體水平效價(jià)低且出現(xiàn)晚，出現(xiàn)在感染后期急性病毒血癥已經(jīng)減弱時(shí)，或者根本不出現(xiàn)。目前這些類型的研究主要基于幼齡動(dòng)物的攻毒實(shí)驗(yàn)。這些研究還發(fā)現(xiàn)，中和抗體在淋巴組織的持續(xù)性感染過程中效價(jià)也未提高至更高水平。但是，這些中和反應(yīng)實(shí)驗(yàn)并未在成年豬上進(jìn)行研究，成年豬經(jīng)歷多次感染或抗原接觸，并隨著動(dòng)物年齡的增長和時(shí)間推移可能會(huì)發(fā)生免疫變化。我們假設(shè)有PRRSV感染史的成年豬的中和抗體反應(yīng)是不同的，首先需要從有PRRSV暴發(fā)史的商品代母豬場中分離并檢測PRRSV中和抗體。

圖1 5個(gè)從174 RFLP型PRRSV暴發(fā)場隨機(jī)抽取血清樣品的廣譜中和反應(yīng)滴度

在兩個(gè)場的多胎次母豬中發(fā)現(xiàn)了高均勻度的高效價(jià)中和抗體，此中和抗體可與2型毒株VR2332反應(yīng)，未知是否接觸相關(guān)疫苗株Ingelvac MLV。2個(gè)群體間最大中和作用是相同的，群體1 中50%中和效力的滴度為512，最高個(gè)體值達(dá)2 187，群體2中50%中和效力滴度為81。中和活力與劑量相關(guān)，曲線結(jié)構(gòu)在兩個(gè)群體間也類似。

南達(dá)科他州立大學(xué)Eric Nelson應(yīng)用目前廣泛使用的熒光聚焦中和實(shí)驗(yàn)（F lurescent Focus Neutralization， FFN）對來自一個(gè)群體的5個(gè)血清樣品使用多個(gè)1型和2型PRRSV分離株進(jìn)行檢測。血清與90%的2型PRRSV毒株發(fā)生反應(yīng)，滴度為16～56；并意外發(fā)現(xiàn)可與90%的I型PRRSV發(fā)生反應(yīng)，滴度大于80。廣譜中和活性與胎次并無相關(guān)性。高滴度中和抗體也在每月使用PRRSV強(qiáng)毒株馴化的后備母豬上發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明：廣譜中和抗體可存在于各種不同生產(chǎn)日齡和不同PRRSV感染群體，包括生長豬、成年豬、強(qiáng)毒力感染和弱毒疫苗免疫。

中和抗體在同一豬場和有感染史豬群間變異系數(shù)均較大。例如，在一個(gè)常規(guī)接種疫苗豬場的所有母豬（N=20）均對VR2332具有同源血清中和活性，滴度范圍為15～256；90%的母豬對MN184具有滴度范圍為4～60的異源中和活性；20%的母豬對MN184具有滴度范圍為4～60的異源中和活性；20%的母豬對1型PRRSV SDEU具有滴度范圍為4～8的異源中和活性。在使用中和反應(yīng)檢測強(qiáng)毒株MW174時(shí)，發(fā)現(xiàn)其生長特征不同于所有其他病毒。在細(xì)胞系中加入相同拷貝RNA的情況下，使用TCID50檢測顯示毒株MW174的感染活性比其他毒株約低1 000倍。由于TCID50是基于細(xì)胞病變效應(yīng)，提示這種高毒力毒株家族可延遲或阻斷細(xì)胞裂解從而獲得更好的生長。從兩個(gè)174毒株暴發(fā)場收集的10母豬樣品顯示，對VR2332、MN184、MW174、NC134和1型毒株SDEU均有中和反應(yīng)活性；22%的樣品（N=50，每種病毒10個(gè)血清樣品）中和反應(yīng)滴度大于256。圖1顯示了同一豬場中5頭不同母豬血清對上述病毒的中和反應(yīng)滴度。

由于廣譜中和反應(yīng)血清可顯著降低異源PRRSV的感染，因此交叉中和反應(yīng)活性非常重要。這些發(fā)現(xiàn)支持了PRRSV交叉保護(hù)的基礎(chǔ)理論，表明免疫相關(guān)的保守表位存在于1型和2型PRRSV中。

注：本文選自2017-AASV論文集

2017-03-08）