婁美玉 劉昌璇 陳文莉

·論著·

哇巴因誘導人足細胞凋亡的作用機制

婁美玉 劉昌璇 陳文莉

目的 足細胞凋亡在狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)發(fā)病過程中有重要作用。內源性哇巴因為強心甾類固醇中的一種，在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者體內表達上調，在5/6腎切除所模擬的慢性腎衰竭大鼠模型體內可誘導腎間質細胞轉分化。本研究主要探討哇巴因在LN中誘導人足細胞(human podocytecell，HPC)凋亡的作用機制。方法 ①體內實驗：選取腎臟腫瘤患者被切除的正常腎組織作為對照組，系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)評分大于5分的活動性LN患者的腎組織作為研究組，通過免疫組織化學檢測腎活檢組織中nephrin的表達改變。②體外實驗：培養(yǎng)HPC，以不同濃度哇巴因(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)刺激HPC不同時間(24 h、48 h、72 h)后，用MTT法觀察并測定哇巴因對HPC增殖凋亡的影響；以不同濃度哇巴因處理HPC 24 h后，采用Hoechst-33258染色檢測細胞凋亡；收集各個濃度哇巴因處理的細胞，用蛋白免疫印跡法檢測鈉鉀ATP酶α1(Na+-K+-ATPase α1，NKAα1)、p-Src、nephrin的表達情況。③HPC用Src激酶抑制劑PP2(1 μmol/L)提前1 h預處理，隨后加入不同濃度哇巴因孵育24 h，收集蛋白，行蛋白免疫印跡，檢測p-Src、nephrin的表達。結果 ①哇巴因以劑量和時間依賴方式誘導HPC凋亡。②正常對照腎組織中nephrin的表達沿腎小球基底膜外側呈均勻、線狀分布，且表達強；LN組腎組織中nephrin在腎小球的分布不均，且表達較正常腎組織明顯減弱。③隨著哇巴因濃度增加，HPC細胞中NKAα1、p-Src的表達先上調再下降，同時可檢測到nephrin蛋白表達逐漸減少。④PP2預處理HPC，阻斷哇巴因對Src的活化，使得p-Src表達下調，逆轉上述效應，逐漸恢復nephrin的表達，使nephrin表達增加。結論 哇巴因通過NKAα1/Src下調nephrin蛋白的表達參與HPC凋亡。

哇巴因；足細胞；凋亡；狼瘡腎炎；鈉鉀ATP酶

狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的常見及嚴重的并發(fā)癥之一。足細胞損傷與足細胞源性的蛋白尿相關，在LN發(fā)病過程中有重要作用[1]，甚至有學者提出足細胞的靶向治療可能是LN治療的新途徑[2]。nephrin的合成或分布異常是腎小球疾病蛋白尿形成機制中關鍵的因素之一。強心甾類固醇(cardiotonicsteroids，CTS)可以抑制鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase，NKA)的活性，在泵功能上影響細胞的濃度梯度的分布。近來發(fā)現(xiàn)CTS可以通過與NKA結合后，激活信號轉導通路(如NKA/Src復合體等)，進而調節(jié)細胞生長、分化、凋亡和纖維化，在心血管疾病、腎臟疾病中發(fā)揮作用。內源性哇巴因為CTS中的一種，本研究主要探討LN中哇巴因誘導人足細胞(human podocyte cell, HPC)凋亡中的作用機制，為治療LN患者足細胞源性的蛋白尿提供新的可能靶點。

材料與方法

一、實驗材料

本實驗所用的細胞系為條件永生性的HPC，來源于美國紐約Mount Sinai醫(yī)學院Peter Mundel教授惠贈。

正常腎臟組織來源于腎腫瘤切除中的正常組織(光學顯微鏡及免疫熒光均提示正常)。LN患者的腎組織來源于腎穿刺活檢病理確診為LN患者的腎活檢，腎穿刺活檢前均未使用過激素或免疫抑制劑類藥物，且系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)評分大于5分的活動性LN患者。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷標準參照2009年美國風濕病學會(ACR)新修訂的SLICC-SLE診斷標準。本研究通過武漢市中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究受試對象均簽署知情同意書。

二、方法

1．免疫組織化學檢測LN患者腎活檢組織中nephrin的表達及分布 以腎臟腫瘤患者被切除正常腎臟組織為正常對照，腎穿刺活檢病理確診為LN患者的腎組織為LN組，采用二步法免疫組織化學檢測nephrin表達及分布情況(檢測試劑盒，北京中杉金橋)。其中，一抗工作濃度為1∶50兔抗人nephrin(英國abcam公司)。實驗步驟和試劑劑量嚴格按照試劑操作說明書進行。

2．細胞培養(yǎng)與分組

(1)細胞培養(yǎng)：未分化足細胞用含10 U/ml γ干擾素的培養(yǎng)基在5% CO2、33 ℃培養(yǎng)孵育箱傳代培養(yǎng)，待達70%融合時，換用37℃培養(yǎng)基(不含γ干擾素)，轉入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)孵箱分化培養(yǎng)10～14 d，刺激前改用1%血清培養(yǎng)基同步化12 h。

(2)實驗分組：①不同濃度哇巴因[0 nmol/L(對照)，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L]刺激不同時間(24 h、48 h、72 h)；②對照組、0.1 nmol/L哇巴因組刺激24 h；③0 nmol/L哇巴因(對照組)、0.1 nmol/L哇巴因組、10 nmol/L哇巴因組、1 μmol/L PP2(Src激酶抑制劑的一種)組、1 μmol/L PP2+0.1 nmol/L哇巴因組、1 μmol/L PP2+10 nmol/L哇巴因組。

3．MTT法檢測HPC的增殖和凋亡 37 ℃體外培養(yǎng)的HPC，將細胞重懸成單個細胞懸液并計數，接種到3個96孔板，次日血清饑餓同步化后加入不同濃度的哇巴因(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，培養(yǎng)終止前4 h每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，吸去孔內培養(yǎng)液后，再加入150 μl DMSO酶標儀490 nm檢測吸光度值(A值)。

4．Hoechst33258檢測細胞凋亡 取泡酸高壓后的潔凈干燥蓋玻片，將蓋玻片置入6孔板內，種入HPC細胞培養(yǎng)，次日血清饑餓同步化后分為對照組和哇巴因組(10 nmol/L)，培養(yǎng)達24 h，吸盡培養(yǎng)液，加入1 ml固定液固定后，采用Hoechst 33258檢測細胞凋亡，實驗步驟和試劑劑量嚴格按照試劑操作說明書進行。采用倒置熒光顯微鏡觀察細胞核染色情況。

5．蛋白免疫印跡法檢測NKA、p-Src、nephrin蛋白的表達 HPC用Src激酶抑制劑PP2(1 μmol/L)提前1 h預處理，隨后加入0.1 nmol/L或10 nmol/L哇巴因孵育24 h，收集各組細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE膠，20 μg/孔上樣，恒壓電泳后恒流轉膜，5%脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉1 h。分別用抗NKAα1抗體1∶5 000(德國Milipore公司)，抗p-Src抗體1∶2 000(英國abcam公司)，抗nephrin抗體1∶400(英國abcam公司)，4 ℃孵育過夜，次日用1‰ TBST溶液洗膜，HRP標記的二抗1∶5 000(美國Dako公司)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒(美國GE公司)顯影。應用GAPDH(德國Milipore公司)作為內參照，稀釋濃度為1∶5 000。Quatity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

三、統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差表示，2組間比較用兩樣本t檢驗，多組間兩兩比較用方差分析(one-way ANOVA)中SNK檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、正常腎組織與LN腎組織nephrin的表達

采用免疫組織化學法檢測nephrin表達及分布情況，并在顯微鏡下觀察、拍照，可觀察到腎組織中nephrin免疫組織化學染色陽性呈棕黃色，正常對照腎組織中nephrin的表達沿腎小球基底膜外側呈均勻、線狀分布，且染色深，LN組腎組織中nephrin在腎小球的分布不均，甚至出現(xiàn)線性消失，且染色較正常腎組織明顯減弱(圖1)。

圖1 腎組織nephrin表達水平

二、哇巴因可誘導HPC凋亡

HPC用不同濃度的哇巴因(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)孵育24 h、48 h及72 h后，用MTT法檢測細胞的增殖和凋亡?？捎^察到隨著哇巴因濃度的增加，細胞受到抑制亦逐漸明顯，并且隨著時間延長，抑制愈明顯。由圖2和表1可見，與對照組相比，除了0.1 nmol/L哇巴因刺激HPC 24 h后差異無統(tǒng)計學意義外，哇巴因各濃度組作用24、48、72 h后，A值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

HPC分為對照組和哇巴因組(10 nmol/L)，培養(yǎng)達24 h，Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而10 nmol/L哇巴因組的細胞中有核固縮現(xiàn)象發(fā)生。(圖3)

注:與對照組(0nmol/L哇巴因)比較,aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001圖2 不同濃度哇巴因不同作用時間對HPC增殖、凋亡的影響

圖3 熒光染色可觀察到HPC凋亡時發(fā)生核固縮現(xiàn)象

表1 不同濃度的哇巴因不同培養(yǎng)時間對HPC增殖和凋亡作用

注：與對照組(0 nmol/L哇巴因)比較，aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001

三、哇巴因活化NKAα1/Src誘導nephrin的表達下調

不同濃度(0 nmol/L，0.1 nmol/L，1 nmol/L，10 nmol/L，100 nmol/L)哇巴因刺激HPC 24 h后，收集各個濃度的細胞，采用蛋白免疫印跡法檢測NKAα1、p-Src、nephrin的表達情況。可觀察到哇巴因不同濃度誘導HPC中NKAα1、p-Src的表達先上調再下降，同時可觀察到nephrin蛋白表達逐漸減少。(圖4)

四、PP2阻斷Src活化、抑制nephrin的表達下調

采用蛋白免疫印跡檢測p-Src、nephrin蛋白表達，可觀察到PP2提前干預HPC后，p-Src蛋白表達下調，并可逆轉哇巴因誘導的nephrin蛋白表達下調，增加nephrin表達量。(圖5)

注:1～5分別代表0、0.1、1、10、100nmol/L哇巴因圖4 不同濃度哇巴因對HPC細胞蛋白表達的影響

注:1為對照組(0nmol/L哇巴因);2為0.1nmol/L哇巴因組;3為10nmol/L哇巴因組;4為1μmol/LPP2組;5為1μmol/LPP2+0.1nmol/L哇巴因組;6為1μmol/LPP2+10nmol/L哇巴因組圖5 Src激酶抑制劑PP2對HPC蛋白表達的影響

討 論

CTS又稱洋地黃類物質，包括植物來源的地高辛、哇巴因和動物來源的布法林(Bufalin)、海蟾蜍毒素(marinobufagenin，MBG)等兩大類，近年來發(fā)現(xiàn)人體內亦存在該類物質(如哇巴因、MBG等)，稱為內源性CTS。CTS存在于心、肝、腎、腦等組織及血漿、尿液與腦脊液中，在體內主要由腎上腺、下丘腦及胎盤等產生和分泌，其產生和分泌受到多種生理和病理因素的調節(jié)，比如鹽攝入增加、妊娠，血管緊張素Ⅱ、促腎上腺皮質激素刺激等。CTS在血漿中主要以游離形式和與蛋白質結合形式存在，游離狀態(tài)CTS在體內具有生物學活性，主要通過與NKA特異性結合，抑制NKA活性，即在泵功能上影響細胞的濃度梯度分布[3]。NKA是一種廣泛存在于真核細胞膜上的膜結合蛋白，主要由四個α亞基(α1、α2、α3、α4)、3個β亞基(β1、β2、β3)和γ亞基組成，每個亞基發(fā)揮著不同的生理作用，α亞基是催化酶反應的亞基，在組織中特異表達，其中，α1亞基是占據主導地位的，幾乎在高等動物所有細胞都有表達，β亞基的主要功能是在細胞質膜上穩(wěn)定α亞基的蛋白構型以及調節(jié)α亞基的活性，γ亞基對已結合的αβ二聚體發(fā)揮調節(jié)作用。近來發(fā)現(xiàn)NKA除了其經典的泵功能，即參與Na+和K+的跨膜轉運外，還具有信號轉導功能[4]，其信號轉導功能主要由α亞基尤其是α1亞基參與。Src家族激酶是膜相關的非受體酪氨酸蛋白激酶，在NKA和Src結合的復合物中NKA的α亞基與CTS結合后，Src的激酶結構域被釋放出，Src得以活化，進而激活下游信號級聯(lián)。在這個過程中，可以把NKA/Src復合物看作一種“二元”受體，受到CTS作用后間接地影響下游蛋白的磷酸化過程，從而介導信號轉導[5]，參與心臟及腎臟相關疾病的發(fā)病過程。

CTS對細胞生長具有重要的調節(jié)作用，研究顯示CTS在調節(jié)細胞生長、分化、凋亡及纖維化中具有重要作用。目前已有研究證實CTS與NKA結合后可激活一系列下游信號通路，從而選擇性抑制腫瘤細胞增殖或促進腫瘤細胞凋亡[6-7]，而正常細胞不受影響，因此具有抗腫瘤活性。在多種血管平滑肌細胞系、豬腎小管上皮細胞-LLC-PK1細胞系等，CTS可刺激細胞增殖[6,8]。因此，CTS對不同細胞的生長具有特異性，既可以調節(jié)細胞的增殖，也可以誘導細胞的凋亡，且這些效應是由于細胞表達鈉鉀ATP酶α1(Na+-K+-ATPase α1，NKAα1)亞基的量不同所造成的[6-7]。哇巴因對細胞生長的調節(jié)除了具有上述的特異性，對同種細胞還具有雙重效應，在低濃度時促進細胞增殖，在較高濃度則促進細胞凋亡，并且在人成纖維細胞、人臍靜脈內皮細胞等細胞上均得到證實[9-10]。諸多研究顯示CTS在諸多疾病及動物模型中升高，如透析患者及部分腎切除所模擬的慢性腎衰竭模型等[11-12]。我們前期研究[13]證實MBG在尿毒癥心肌病變中表達上調，NKAα1亞基的量決定細胞存活和凋亡的方向，更進一步證實了上述研究結果。有研究[14-15]發(fā)現(xiàn)MBG能誘導心腎纖維化，抗MBG抗體可減弱纖維化發(fā)生。內源性哇巴因在慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者體內表達上調[16]，MBG可誘導豬腎小管上皮細胞發(fā)生間質細胞轉分化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)，在大鼠體內可誘導腎纖維化[17]。近年研究發(fā)現(xiàn)心臟手術前哇巴因高水平患者易發(fā)生亞臨床腎損害，并極有可能因麻醉或手術而加重，增加心臟手術后急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的發(fā)生率，因而術前循環(huán)哇巴因水平可強烈預測AKI的發(fā)生或作為AKI臨床風險評分因子，哇巴因可能直接引起腎損傷[18]。研究還發(fā)現(xiàn)，術前和術后哇巴因可作為心力衰竭的標志物，甚至可預測術后發(fā)生心血管事件風險，不僅具有診斷性意義，還為心力衰竭的治療提供了方向[19]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)哇巴因的持續(xù)升高，可降低肌酐清除率，增加尿蛋白排泄，減少選擇性足細胞標記蛋白nephrin的表達，引起足細胞損害和蛋白尿[18]，關于哇巴因如何調節(jié)LN中足細胞nephrin蛋白的表達機制尚不明確。

LN是系統(tǒng)性紅斑狼瘡累及腎臟的常見及嚴重的并發(fā)癥之一，雖然糖皮質激素聯(lián)合細胞毒藥物已廣泛應用于治療中，并被公認為是經典的治療方案，但持續(xù)使用免疫抑制劑帶來的不良后果一直是治療中難以避免的問題。因此，針對LN的發(fā)病機制尋找具有多靶點作用、療效機制明確的新型藥物，從而減少對免疫抑制劑的依賴，一直是國內外腎臟病學者最為關注的熱點問題。

現(xiàn)有的研究表明，LN的發(fā)病機制中除了免疫調節(jié)的紊亂外，其腎臟局部細胞的功能失調也是造成疾病進展的重要原因之一，細胞凋亡的異常與LN的發(fā)病密切相關已有相關報道[20]。足細胞是腎小球固有細胞的重要組成部分，和內皮細胞、腎小球基底膜共同組成腎小球濾過屏障。足細胞損傷在LN發(fā)病過程中有重要作用，可引起足細胞源性的蛋白尿的發(fā)生[1]。nephrin蛋白是足細胞裂隙膜關鍵分子之一，參與構成腎小球濾過屏障，已有研究顯示nephrin分子與蛋白尿及濾過屏障密切相關[21-22]，nephrin的合成或分布異常是腎小球疾病蛋白尿形成機制中關鍵的因素之一。在不同腎臟疾病中，nephrin蛋白分布均有異常，除了在阿霉素腎病模型中有報道nephrin蛋白表達是上升的，在常見腎病及模型中表達下降，關于nephrin在LN腎組織中的表達結果不一。Huh等[23]報道顯示LN患者腎活檢組織中nephrin表達減少。nephrin可通過Src家族激酶起到信號轉導作用，NKA在腎臟除了富集于近端腎小管上皮細胞、集合小管細胞外，在足細胞亦表達NKA。目前關于哇巴因在LN中對人足細胞及nephrin表達的作用尚不清楚?；谝陨系难芯炕A，我們設計了此課題，在本結果中采用免疫組織化學法檢測到nephrin在正常對照腎組織中沿腎小球基底膜外側呈均勻、線狀分布，在LN腎組織中分布不均，甚至出現(xiàn)線性消失，且LN腎活檢組織中nephrin表達較正常對照組明顯減弱，這與Huh等[23]的報道是一致的；體外實驗研究發(fā)現(xiàn)哇巴因可以誘導HPC凋亡，不同濃度的哇巴因刺激HPC不同時間后可觀察到哇巴因以時間和劑量依賴的形式誘導足細胞凋亡發(fā)生，其中，10 nmol/L哇巴因刺激HPC 24 h后可以觀察到細胞中有核固縮現(xiàn)象發(fā)生，意味著HPC發(fā)生凋亡；蛋白免疫印跡法可以檢測到隨著哇巴因濃度的增加，NKA α1、p-Src的表達先增加后減少，同時我們也檢測到了nephrin的表達逐漸減少，采用Src家族激酶抑制劑PP2預處理HPC，阻斷哇巴因對Src的活化，可逆轉上述效應，逐漸恢復nephrin的表達，使nephrin表達增加。我們的研究證實了哇巴因可以通過NKA/Src信號通路下調nephrin表達，誘導LN患者足細胞凋亡，參與LN發(fā)病，可能是LN發(fā)生足細胞源性的蛋白尿的原因之一。

本研究集中在體外實驗對部分機制的探討，雖涉及組織標本，但是仍缺乏狼瘡動物模型對該機制的進一步證實，不過這也是我們接下來需要深入研究的部分。另外，該研究對LN中哇巴因誘導的足細胞凋亡的機制探討尚不完全，需要進一步深入研究，為LN的治療提供更多的治療靶點。產生蛋白尿機制的研究表明nephrin表達減少會造成足細胞凋亡、脫落和融合，采取有效的措施保護足細胞，阻斷nephrin的減少，將為治療LN患者足細胞源性的蛋白尿提供新的可能靶點，有助于延緩LN患者病情進展。

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Molecular mechanism of ouabain-induced apoptosis in human podocytes

LOUMei-yu,LIUChang-xuan,CHENWen-li.

DepartmentofNephrology,WuhanCentralHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China

CHENWen-li,E-mail:whwenli@163.com

Objective Podocyte apoptosis is involved in lupus nephritis (LN). Endogenous ouabain (EO), one of cardiotonicsteroids (CTS), is markedly up-regulated in chronic kidney disease (CKD) patients and is associated with epithelial-to-mesenchymal transition during renal fibrosis in the remnant kidney of 5/6 nephrectomy rats. This study is to explore the molecular mechanism of ouabain-induced apoptosis of human podocytes in LN.Methods (1) In the in vivo experiment, the expression of nephrin protein was detected by immunohistochemistry in renal biopsy specimens from patients with active LN whose SLEDAI scores were more than 5 and those as control group from normal renal tissues in patients with renal tumor after resection of the tumor tissues. (2) In the in vitro experiment, cultured podocytes were treated with different doses of ouabain (0, 0.1, 1, 5, 10 and 100 nmol/L) for different durations (24, 48 and 72 h). The MTT method was applied to assay cell proliferation and apoptosis. The apoptosis of podocytes was assessed by Hoechst 33258 staining. Western blotting was used to measure Na+-K+-ATPase α1 (NKAα1), p-Src and nephrin. The PP2 (1 μmol/L) was administered from 1 h before the addition of ouabain and continued throughout the 24 h. Western blotting was then employed to examine the expression of proteins above.Results (1) Ouabain induced human podocyte apoptosis in a dose- and time-dependent manner; (2) Nephrin staining showed an even pattern and the expression of nephrin decreased in LN as compared with controls whose nephrin showed an even and linear pattern; (3) Ouabain reduced the expression of nephrin through changing the expression of NKAα1 and p-Src; (4) Inhibition of Src kinase by PP2 increased the expression of p-Src and restored nephrin-expression.Conclusions Ouabain induced human podocyte apoptosis by NKAα1/Src complex decreasing nephrin.

Ouabain; Podocyte; Apoptosis; Lupus nephritis; Na+-K+-ATPase

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.03.004

國家自然科學基金(No.81400734)；湖北省自然科學基金(No.2015CFB241)

430014 武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院腎內科

陳文莉，E-mail：whwenli@163.com

2017-01-22

2017-02-28)