張繼州+周春權(quán)+李細彬+雷華杰+韓靜+賀肇東+胡娟

【摘要】目的：研究畬藥“十二時辰”水煎劑對小鼠的急性毒性，以初步評價其安全性。方法：以不同劑量“十二時辰”水煎劑對小鼠灌胃，觀察毒性癥狀，記錄死亡情況，并計算最大耐受量（MTD）、最小致死量（MLD）及半數(shù)致死量（LD50）的值。結(jié)果：小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量（MTD）為2744g/kg，最小致死量（MLD）為392g/kg，半數(shù)致死量（LD50）為6008g/kg。結(jié)論：“十二時辰”臨床應(yīng)用時，需嚴格控制口服劑量。

【關(guān)鍵詞】十二時辰；急性毒性；最大耐受量；最小致死量；半數(shù)致死量

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）08-0027-03

“十二時辰”為毛茛科植物重瓣鐵線蓮Clematis florida Thunb var.plena DDon的干燥根[1]，為福建福安畬醫(yī)習(xí)用藥?！陡０伯屷t(yī)畬藥》記載，其性溫、味辛，具有通經(jīng)活絡(luò)、通關(guān)竅、怯風除濕、活血止痛、理氣通便、利尿、解毒等功效，主治跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛，蟲蛇咬傷[2]；《中華本草》記載其“味苦、微辛； 性溫，小毒，歸肝、脾、腎經(jīng)，可利尿、通絡(luò)、理氣通便、解毒”，主治風濕性關(guān)節(jié)炎、小便不利、閉經(jīng)、便秘腹脹、風火牙痛、眼起星翳、蟲蛇咬傷、黃疸等[3]，是一味地方特色鮮明的民族藥，值得進一步研究并加以開發(fā)應(yīng)用。關(guān)于十二時辰的化學(xué)成分，近年已有相關(guān)報道[4-5]，其主要活性成分包括棕櫚酸及其甲酯、乙酯以及齊墩果酸等。但迄今為止，對于“十二時辰”及其原植物重瓣鐵線蓮的安全性評價還未見文獻報道。研究通過小鼠口服不同劑量“十二時辰”水煎劑，觀察毒性癥狀，記錄死亡情況，并計算最大耐受量（MTD）、最小致死量（MLD）及半數(shù)致死量（LD50）的值，為其臨床安全使用奠定基礎(chǔ)。

1儀器與材料

11儀器與試藥YP502N電子天平（上海精密科學(xué)有限公司）、WK2102電磁爐（美的），“十二時辰”生藥（批號：20160501）購買自福建福安。

12實驗動物清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體重20～22g，購自上海斯萊克實驗動物中心（合格證號：SCXK（滬）2012-0002），光暗周期12/12 h（光照時間8∶00～20∶00）下飼養(yǎng)，自由飲食，室溫保持 18～22℃，相對濕度 40%～70% ，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。

2方法

21水煎劑制備用電子天平稱取“十二時辰”藥材400g，加水12倍體積煎煮1h，再先后加水10倍體積和8倍體積各煎煮05h，合并三次煎煮液，濃縮至200mL，即得2g/mL濃縮液備用，用時再用蒸餾水配成相應(yīng)濃度。

22最大耐受量和最小致死量的測定預(yù)試驗中，80g/kg劑量的“十二時辰”水煎劑灌胃造成小鼠全部死亡，而8g/kg及08g/kg兩劑量無死亡。因此正式試驗中，在80g/kg和8g/kg劑量之間，以070等比組距，設(shè)置5個劑量組，其劑量分別為56g/kg、392g/kg 、2744g/kg、192g/kg、1344g/kg。

實驗動物隨機分為5個實驗組及1個空白對照組，每組10只，雌雄各半，實驗前禁食不禁水16h。各實驗組按04mL/10g體重灌胃給予上述劑量“十二時辰”水煎劑，空白對照組給予等體積的蒸餾水，觀察其毒性癥狀，記錄死亡情況，確定小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量（MTD）和最小致死量（MLD）。

23LD50的測定參考22結(jié)果，經(jīng)預(yù)試驗，得出小鼠口服“十二時辰”水煎劑的100%致死量（Dm）為64 g/kg，0%致死量（Dn）為328g/kg，兩者之比接近2倍。故根據(jù)改良寇氏法（Krber氏法）[6]，參考Dm和Dn，以085等比組距，設(shè)置6個劑量組，其劑量分別為753g/kg、64g/kg、544g/kg、462g/kg、393g/kg、334g/kg。

實驗動物隨機分為6個實驗組及1個空白對照組，每組10只，雌雄各半，實驗前禁食不禁水16小時。各實驗組按04mL/10g體重灌胃給予上述劑量“十二時辰”水煎劑，空白對照組給予等體積的蒸餾水，觀察其毒性癥狀，記錄死亡情況，并計算小鼠口服“十二時辰”水煎劑的半數(shù)致死量（LD50）。

24統(tǒng)計描述及LD50計算方法實驗數(shù)據(jù)以各實驗組動物死亡率表示，LD50采用改良寇氏法計算，計算公式如下：

LD50=log-1{Xm-i[∑p-（3-pm-pn）/4]}

其中：Xm為最大劑量組劑量的對數(shù)；i為相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對數(shù)；p為各組動物的死亡率；∑p為各組p值之和；pm為最高劑量組死亡率；pn為最低劑量組死亡率。

LD50的95%可信區(qū)間計算公式如下：

LD50的95%可信區(qū)間=LD50±45LD50·i∑p-∑p21n-1

其中：i為相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對數(shù)；p為各組動物的死亡率；n為每組的動物數(shù)量。

3結(jié)果

31一般情況觀察空白對照組小鼠精神良好，活動正常，無死亡?！笆r辰”水煎劑組隨劑量升高，有靜伏不動、活動減少，死亡前抽搐等毒性現(xiàn)象。

32最大耐受量和最小致死量的測定由表1可知，小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量（MTD）為2744 g/kg，最小致死量（MLD）為392g/kg。

33“十二時辰”水煎劑的LD50的測定各組死亡情況見表2根據(jù)改良寇氏法，將表2數(shù)據(jù)代入計算公式得：LD50=6008 g/kg；LD50的95%可信區(qū)間為5442～6573g/kg。

4討論

急性毒性試驗是藥物安全性評價的第一步，為后續(xù)的長期毒性試驗、特殊毒性試驗及藥效學(xué)、藥理學(xué)研究中劑量選擇和指標設(shè)計提供重要的參考依據(jù)，同時也為臨床安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

半數(shù)致死量LD50是藥物的重要特征性參數(shù)，準確測定LD50是合理用藥、安全用藥的重要前提[6]。本次試驗滿足三個條件：①反應(yīng)量大致呈正態(tài)分布；②給藥濃度按照等比級數(shù)排列；③各組動物數(shù)相等，故采用改良寇氏法（Krber 氏法）作為LD50的計算方法。然而單純依靠LD50作為急性毒性指標具有一定的缺陷，例如，無法反映不引發(fā)動物死亡的劑量與引發(fā)動物死亡的劑量之間的范圍。因此，配合最大耐受量（MTD）及最小致死量（MLD）等相關(guān)數(shù)據(jù)，可以反映藥物毒作用帶的寬度，更全面地表示藥物的毒性。研究中，小鼠口服“十二時辰”水煎劑的最大耐受量（MTD）為2744 g/kg，最小致死量（MLD）為392g/kg，半數(shù)致死量（LD50）為6008 g/kg，其95%可信區(qū)間為5442～6573g/kg。按照藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算，半數(shù)致死量（LD50）的值相當于60kg體重成人服用2920g生藥[7]，根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級標準，該藥材屬低毒藥材。LD50約為MLD的兩倍，說明口服“十二時辰”水煎劑后，自出現(xiàn)小鼠死亡的最低劑量至半數(shù)小鼠死亡的劑量存在一定距離，毒劑量帶有一定的寬度。此外，小鼠口服“十二時辰”后的毒性現(xiàn)象可知，在致死劑量下其毒作用較為明顯，但具體的機制以及靶器官尚需要進一步實驗研究加以確認，并與同為鐵線蓮屬的其他藥用植物加以對比。

參考文獻

[1]黃澤豪，張月玲. 畬藥十二時辰的本草考證[J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2014，23（1）：2-3.

[2]鐘隱芳.福安畬醫(yī)畬藥[M].福州：海風出版社，2010：109-110.

[3]《中華本草》編委會. 中華本草（第三輯） [M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：198.

[4]黃澤豪，郭家欣，沈賢娟. 畬藥十二時辰揮發(fā)油的GC-MS分析[J]. 福建中醫(yī)藥，2014，45（1）：52-53.

[5]劉知遠，沈廷明，李細彬，等. HPLC 法測定畬藥十二時辰中活性成分齊墩果酸的含量[J]. 中國藥師，2016，19（9）：1758-1760.

[6]周立國. 藥物毒理學(xué)[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009：141-142，131-132.

[7]黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理實驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9 （9）：1069.

（收稿日期2017-02-17：編輯：梁志慶）