趙宏玉，張根生，張紅城

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

贊比亞蜜中多酚類化合物的研究

趙宏玉1，2，張根生1，*張紅城1，2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

贊比亞蜜是贊比亞特有的珍貴蜂蜜，具有比其他蜂蜜品種更為明顯的降血壓效果。利用固相萃取-高效液相色譜法結(jié)合LC-MS/MS研究贊比亞蜜樣品中多酚類化合物成分及含量，結(jié)果表明，贊比亞蜜中含有脫落酸，芥子酸、柯因、短葉松素-3-乙酸酯、山奈酚及p-香豆酸。其中，以柯因的含量最高，為51.44 μg/100 g，脫落酸次之。

贊比亞蜜；多酚類成分；高效液相色譜法；液相-二級質(zhì)譜聯(lián)用

0 引言

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜或者其他生長部位的分泌物，與自身特定物質(zhì)結(jié)合，并經(jīng)由沉積、脫水、儲存和離開蜂巢后成熟所形成的天然甜味物質(zhì)[1]。新鮮蜂蜜為透明或半透明狀液體，有較濃郁的香味，低溫放置一段時間后，部分蜂蜜會變?yōu)榻Y(jié)晶體。不同品種的蜂蜜，色澤也有所不同，從水白色到深琥珀色共分為7個等級[2]。人們不僅把蜂蜜用于食品，也將其作為一種常用中藥。中醫(yī)認(rèn)為蜂蜜性味甘、平，具有滋補(bǔ)潤肺、潤腸、通便的功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將蜂蜜列為上品[3]。

近年來，蜂蜜作為保健食品在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用。贊比亞是非洲中南部內(nèi)陸國家，有世界著名的維多利亞瀑布、莫西奧圖尼亞瀑布、卡里巴湖等，自然資源十分豐富[4]。當(dāng)?shù)氐木用駛鞒械摹耙起B(yǎng)法”養(yǎng)蜂采蜜技術(shù)已有500多年歷史。贊比亞蜜是贊比亞特有的珍貴蜂蜜，具有獨特的厚重醇香味，顏色呈深咖啡色，被譽(yù)為“天然黑金”。贊比亞的花蜜來源為睦朋得樹，該樹的花朵具有平衡血糖、血壓、血脂等功效[5]；樹皮可做藥材，用于治療胃病、腹瀉等；果實呈金黃色，微甜，具有獨特的營養(yǎng)價值和藥用價值[6]。

多酚類成分廣泛存在于自然界中。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)具有較好的藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等[7-9]。來源于天然植物中的多酚類物質(zhì)成為近年來的熱點問題，有大量的研究已經(jīng)對蜂蜜中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行報道。而對于獨特的贊比亞蜜的研究卻仍處于起步階段，贊比亞蜜中的多酚類物質(zhì)尚不明確。采用固相萃取-高效液相色譜法結(jié)合LC-MS/MS研究贊比亞蜜中多酚類化合物成分及含量，旨在為其保健功能的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

甲醇、氨水、甲酸、無水乙醇等分析純，購于北京化學(xué)試劑有限公司；乙酸，購自J.T Baker公司；色譜級甲醇，購自美國Fisher公司；順，反-脫落酸、反，反-脫落酸，購自成都生物技術(shù)有限公司；p-香豆酸、芥子酸、山柰酚、柯因和短葉松素-3-乙酸酯，均購自美國Sigma公司；試驗用水為超純水。

1.2 試驗材料

贊比亞蜜樣品產(chǎn)自贊比亞，于2016年購入，樣品收集后置于4℃冰箱保存。

1.3 主要儀器與設(shè)備

微量移液器，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Seven Easy型pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器責(zé)任有限公司產(chǎn)品；LC-6AD型高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；Sorvall Biofuge Startos型臺式離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；1290型超高效液相色譜儀，UHPLC，6540四級桿-飛行時間質(zhì)譜（QTOF MS），安捷倫科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Strata-X-A型固相萃取柱，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Intergral型純水/超純水一體化系統(tǒng)，美國Merk Millipore公司產(chǎn)品；24孔固相萃取裝置，美國Supelco公司產(chǎn)品；真空微孔濾膜過濾裝置，北京京輝凱業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；0.22 μm微孔濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；無菌注射器，廣東康爾美醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗方法

1.4.1 蜂蜜樣品的前處理

試驗所用方法是在Dimitrova[10]和孫春麗[11]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體操作流程如下：①用固相萃取柱對贊比亞蜜進(jìn)行前處理，首先4 mL分析級甲醇對Strata-X-A固相萃取柱活化，再用4 mL超純水（pH值為7）對Strata-X-A固相萃取柱平衡；②配置0.25 g/mL的蜂蜜水，攪拌（若蜂蜜樣品結(jié)晶，可進(jìn)行超聲混勻）。然后用稀氨水緩慢調(diào)節(jié)，使蜂蜜溶液pH值為7；③用離心機(jī)除去蜂蜜中的固體雜質(zhì)，離心條件為8 000 g/12 min，取上清液倒入固相萃取柱中；④取萃取后的柱子，用3 mL pH值為7的超純水進(jìn)行洗脫，主要去除粘在柱子上的糖類化合物和其他雜質(zhì)，再用5 mL含5%甲酸的分析級甲醇溶液進(jìn)行洗脫；⑤將洗脫液收集于試管中，并用氮吹儀（配有恒溫水浴鍋）吹干，再用2 mL色譜級甲醇進(jìn)行酚類化合物的復(fù)溶，最后過0.22 μm濾膜后存放于樣品瓶中，4℃冰箱中保存，備用。

1.4.2 贊比亞蜂蜜的HPLC色譜分析條件和質(zhì)譜分析條件

（1）HPLC色譜分析條件。色譜柱：150 mm× 4.6 mm，5 μm（Phenomenex Gemini C18），具體參數(shù)設(shè)置為柱溫箱溫度35℃，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量20 μL。流動相：A相是水（含有2%的乙酸），B相是甲醇（含有2%的乙酸），總流速0.7 mL/min。

贊比亞蜜的梯度洗脫程序見表1。

表1 贊比亞蜜的梯度洗脫程序

總體洗脫時間為135 min，流動相甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從9%變化到80%。

（2）質(zhì)譜分析條件。電離源為電噴霧離子化（ESI），檢測器是正、負(fù)離子雙檢測模式，加熱溫度至350℃，離子源噴出的電壓4.5 kV，出口電壓130 V，氮氣（N2）的流速12 L/min，碰撞氣體為氦氣，霧化氣的速度80 kPa，霧化器的壓力40 psi，掃描范圍在60～800 Da。

1.4.3 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液

稱取一定質(zhì)量的p-香豆酸、順，反-脫落酸、反，反-脫落酸、芥子酸、柯因、短葉松素-3-乙酸酯和山奈酚，配置成10 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。將不同的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別以5，10，15，20，25 μL進(jìn)樣量進(jìn)行HPLC色譜分析，根據(jù)峰面積和不同的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量建立各個標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

各個不同標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 各個不同標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 贊比亞蜜樣品中多酚類化合物的定性分析

贊比亞蜜樣品HPLC色譜圖見圖1。

在已經(jīng)試驗的基礎(chǔ)上，采用對蜂蜜中酚酸類化合物的吸附和回收效果最好的Strata-X柱進(jìn)行贊比亞蜜的前處理，檢測出贊比亞蜜中7種多酚類化合物。贊比亞蜜中的化合物名稱、在贊比亞蜜梯度洗脫程序中的相對保留時間、紫外光譜的最大吸收波長、化合物的分子質(zhì)量以及在質(zhì)譜上的具體信息詳見表3。

圖1 贊比亞蜜樣品HPLC色譜圖

圖2 正、負(fù)離子雙模式下檢測的p-香豆酸的質(zhì)譜圖

圖3 正、負(fù)離子雙模式下檢測的芥子酸的質(zhì)譜圖

表3 贊比亞蜜樣品中化合物和MS，UV以及Rt特征

贊比亞蜜樣品中化合物和MS，UV以及Rt特征見表3。

按照上述的質(zhì)譜條件，測定贊比亞蜜中7個色譜峰之一（1號峰）的準(zhǔn)分子量。

正、負(fù)離子雙模式下檢測的p-香豆酸的質(zhì)譜圖見圖2。

在圖2（a）中的正離子雙模式下質(zhì)譜圖中含有1個165.054 6 m/z[M+H]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰和一個187.1129 m/z[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰；在圖2（b）負(fù)離子雙模式檢測的的質(zhì)譜圖中存在1個163.039 3 m/z[M-H]-準(zhǔn)分子離子碎片峰。結(jié)合表3中p-香豆酸的MS值的相關(guān)信息以及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，由此可以推斷，分子量是164，該化合物應(yīng)為p-香豆酸。

按照上述質(zhì)譜條件，測定贊比亞蜜中7個色譜峰之一（2號峰）的準(zhǔn)分子量，結(jié)果見正負(fù)離子質(zhì)譜圖。

正、負(fù)離子雙模式下檢測的芥子酸的質(zhì)譜圖見圖3。

在圖3（a）中的正離子質(zhì)譜圖里含有1個225.123 0 m/z[M+H]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰和1個247.102 5 m/z[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰；在圖3（b）負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖中包含有223.061 1 m/z [M-H]-的準(zhǔn)分子離子碎片峰。結(jié)合表3中芥子酸的MS值的相關(guān)信息以及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，由此可以推斷，分子量是224，該化合物應(yīng)為芥子酸。

按照上述的質(zhì)譜條件，測定贊比亞蜜中7個色譜峰之一（3號峰）的準(zhǔn)分子量，結(jié)果見正負(fù)離子質(zhì)譜圖。

正、負(fù)離子雙模式下檢測的反，反-脫落酸的質(zhì)譜圖見圖4。

在圖4（a）中的正離子質(zhì)譜圖里含有1個265.118 6 m/z[M+H]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰和1個287.094 8 m/z[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰；在圖4（b）中的負(fù)離子模式檢測的質(zhì)譜圖里含有1個263.129 5 m/z[M-H]-的準(zhǔn)分子離子碎片峰。結(jié)合表3中反，反-脫落酸的MS值的相關(guān)信息以及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，可以推斷，分子量為264，該化合物是反，反-脫落酸。

按照上述質(zhì)譜條件，測定贊比亞蜜中7個色譜峰之一（4號峰）的準(zhǔn)分子量，結(jié)果見正負(fù)離子質(zhì)譜圖。

正、負(fù)離子雙模式下檢測的順，反-脫落酸的質(zhì)譜圖見圖5。

圖4 正、負(fù)離子雙模式下檢測的反，反-脫落酸的質(zhì)譜圖

圖5 正、負(fù)離子雙模式下檢測的順，反-脫落酸的質(zhì)譜圖

在圖5（a）中的正離子質(zhì)譜圖里含有1個287.095 2 m/z[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰；在圖5（b）的負(fù)離子模式檢測的質(zhì)譜圖里含有1個263.120 5 m/z[M-H]-的準(zhǔn)分子離子碎片峰。結(jié)合表3中順，反-脫落酸的MS值相關(guān)信息以及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，可以推斷：該化合物的分子量為264，該化合物是順，反-脫落酸。

按照上述的質(zhì)譜條件，測定贊比亞蜜中7個色譜峰之一（5號峰）的準(zhǔn)分子量，結(jié)果見正負(fù)離子質(zhì)譜圖。

正、負(fù)離子雙模式下檢測的山奈酚的質(zhì)譜圖見圖6。

從圖6可知，負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖中包含有285.041 0 m/z[M-H]-準(zhǔn)分子離子碎片峰；圖6（a）的正離子模式的質(zhì)譜圖里含有1個309.035 7 m/z [M+Na]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰和287.054 5 m/z[M+H]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰。結(jié)合表3中山奈酚的MS值相關(guān)信息以及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，可以推斷其分子量為286，該化合物為是山奈酚。

按照上述的質(zhì)譜條件，測定贊比亞蜜中7個色譜峰之一（6號峰）的準(zhǔn)分子量，結(jié)果見正負(fù)離子質(zhì)譜圖。

正、負(fù)離子雙模式下檢測所得到的短葉松素-3-乙酸酯的質(zhì)譜圖見圖7。

圖6 正、負(fù)離子雙模式下檢測的山奈酚的質(zhì)譜圖

圖7 正、負(fù)離子雙模式下檢測所得到的短葉松素-3-乙酸酯的質(zhì)譜圖

在圖7（a）中的正離子質(zhì)譜圖里含有1個315.050 2 m/z[M+H]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰；在圖7（b）負(fù)離子模式的質(zhì)譜圖中包含有313.238 5 m/z [M-H]-準(zhǔn)分子離子碎片峰。結(jié)合表3中短葉松素-3 -乙酸酯的MS值相關(guān)信息以及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，可以推斷其分子量是314，該化合物應(yīng)為短葉松素-3-乙酸酯。

按照上述質(zhì)譜條件，測定贊比亞蜜中7個色譜峰之一（7號峰）的準(zhǔn)分子量，結(jié)果見正負(fù)離子質(zhì)譜圖。

正、負(fù)離子雙模式下柯因的質(zhì)譜圖見圖8。

從圖8（a）可以看出，正離子質(zhì)譜圖中包含有255.067 5 m/z[M+H]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰和287.091 0 m/z[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子碎片峰，在圖8（b）的負(fù)離子質(zhì)譜圖中含有1個253.087 2 m/z[M-H]-的準(zhǔn)分子離子碎片峰。結(jié)合表3中MS值相關(guān)信息以及標(biāo)準(zhǔn)品的對比，因此可以推測其分子量為254，該化合物為柯因。

2.2 贊比亞蜜樣品中多酚類化合物的定量分析

贊比亞蜜樣品中的多酚類化合物和脫落酸見表4。

圖8 正、負(fù)離子雙模式下柯因的質(zhì)譜圖

表4 贊比亞蜜樣品中的多酚類化合物和脫落酸

贊比亞蜜樣品中共鑒定出7種化合物，包括2種酚酸類化合物，3種黃酮類化合物和2種脫落酸。贊比亞蜜樣品的酚酸含量平均值為15.79 μg/100 g，黃酮含量平均值為35.40 μg/100 g。此外，在鑒定出的所有化合物中，柯因的含量最高，為51.44 μg/100 g。研究表明，柯因是合成降血脂、防心腦血管疾病、抗菌、消炎等藥品的原料[12-13]。根據(jù)試驗結(jié)果推斷，柯因或許是贊比亞蜜具有降血壓作用的一個關(guān)鍵性因素。脫落酸的含量僅次于柯因，并且在贊比亞蜜中鑒定出2種脫落酸，分別為反，反-脫落酸和順，反-脫落酸。脫落酸（ABA）是植物五大天然生長調(diào)節(jié)劑之一，能夠應(yīng)對外界環(huán)境的變化，保護(hù)植物生長。研究表明，蜂蜜中一般均含有脫落酸，也有報道證明脫落酸具有明顯的抗氧化作用。

3 結(jié)論

通過固相萃取-高效液相色譜法結(jié)合LC-MS/MS研究了贊比亞蜜樣品中多酚類化合物成分及含量。共檢測出7種多酚類化合物，包括p-香豆酸、脫落酸、芥子酸、短葉松素-3-乙酸酯、山奈酚以及柯因。其中，以柯因的含量為最高，脫落酸次之。旨在為贊比亞蜜的開發(fā)和利用提供理論參考依據(jù)，為進(jìn)一步研究贊比亞蜜中的營養(yǎng)學(xué)和生物學(xué)功能奠定了良好的基礎(chǔ)，以期為開發(fā)贊比亞特色蜂蜜提供一定的理論依據(jù)。

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The Study of Polyphenolson Zanbia Honey

ZHAO Hongyu1，2，ZHANG Gensheng1，*ZHANG Hongcheng1，2
（1.Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150010，China；2.Institute of Bees，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093，China）

As Zambia unique precious honey，Zambia honey have obvious effect in lowering blood pressure than other varieties.In this study，solid-phase extraction-high performance liquid chromatography coupled with LC-MS/MS is used to study the composition and content of polyphenols in honey samples from Zambia.The results show that abscisic acid，sinapic acid，p-coumaric acid，pinobanksin-3-acetate，kaempferol and chrysine are found in Zambia honey samples.Among them，the highest content of Chrysine have 51.44 μg/100 g，abscisic acid followed.

Zambia honey；polyphenols；HPLC；LC-MS/MS

O614

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.001

1671-9646（2017）03a-0001-05

2017-01-11

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目（CARS-45-KXJ18）。

趙宏玉（1992—），女，在讀碩士，研究方向為蜂產(chǎn)品應(yīng)用與加工。

*通訊作者：張紅城（1967—），男，博士，副研究員，研究方向為功能食品與生物活性物質(zhì)、食品生物技術(shù)。