韋 璇 姚依蘭 馮 閣 黃鳳華 張西鋒 鄢又玉

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

塑化劑影響小鼠乳腺發(fā)育的研究

韋 璇 姚依蘭 馮 閣 黃鳳華 張西鋒 鄢又玉*

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

為了探討塑化劑DEHP對小鼠乳腺發(fā)育的影響。本研究通過灌服DEHP的方式處理見栓孕鼠，并利用HE染色、RNA提取及基因芯片分析、基因表達譜的方法，分析了DEHP對小鼠乳腺發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：經(jīng)DEHP處理后，孕鼠乳腺的終端導(dǎo)管數(shù)量顯著增加，孕鼠乳腺早期發(fā)育的基因表達模式被改變。由此表明，DEHP可影響小鼠乳腺的發(fā)育。

塑化劑 小鼠 乳腺

塑化劑（鄰苯二甲酸（2─乙基己基）二酯，DEHP）是一種有毒的化工業(yè)用塑料軟化劑。DEHP的分子化學(xué)式是C24H38O4，分子量390.56。它是一種油狀的、澄清透明的、無色無臭的液體。具有難溶于水，易溶于有機溶劑的性質(zhì)，可以與多種高分子物質(zhì)進行良好的液—液互溶。在工業(yè)產(chǎn)品中加入DEHP可使微粒分子更均勻散布，從而增加產(chǎn)品的彈性、延展性和柔軟度?；谝陨蟽?yōu)點，DEHP廣泛地用于醫(yī)療用的輸血袋、塑膠手套和醫(yī)療設(shè)備、膠管、盛裝食物的塑膠容器、兒童塑膠玩具、清潔材料和殺蟲劑等[1]。大量的消費品和日常用品中都含有DEHP，人們廣泛地接觸DEHP，其安全性引起人們的關(guān)注。

人類終生通過不同的途徑接觸不同來源的DEHP，它對人體的危害是防不勝防的。DEHP是內(nèi)分泌干擾物（endocrinedisrupting compounds，EDCs）的一種，可以通過雌激素受體發(fā)揮作用[2]。DEHP等內(nèi)分泌干擾物的暴露會對性腺的發(fā)育造成傷害，造成卵巢早衰、卵母細胞發(fā)育失敗等[3-4]。現(xiàn)有的研究表明，乳腺癌的發(fā)生與EDCs的暴露之間具有潛在的相關(guān)性，EDCs的暴露會增加出現(xiàn)乳腺癌的風險[5-6]。DEHP作為EDCs的之一，其暴露對妊娠早期孕鼠的乳腺發(fā)育和相關(guān)基因表達模式的影響值得關(guān)注。

本研究以妊娠早期母鼠為研究對象，探討DEHP暴露對乳腺發(fā)育和基因表達模式的影響及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗小鼠為CD1品系，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物房保持每天光照12 h和黑暗12 h交替，濕度35±4%，溫度24±1 ℃的條件。

1.1.2 實驗材料

實驗小鼠的乳腺組織一部分用于HE染色分析，一部分用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 實驗小鼠的處理

母鼠見栓后的0.5d到3.5 d期間以0（對照）、20μg/kg、40μg/ kg的劑量每天灌服處理。在3.5d和7.5d時收集孕鼠乳腺組織用于乳腺發(fā)育的整體分析和總RNA提取等。

1.2.2 小鼠乳腺組織分離和染色

小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死后，剝離第四對乳腺，用4%甲醛溶液固定24h；然后用雙蒸水沖洗固定的乳腺組織，置于洋紅-硫酸鋁鉀溶液中4℃過夜；再進行乙醇和甲苯的處理，把處理好的乳腺組織浸泡在水楊酸甲酯中，用于體視顯微鏡觀察。

1.2.3 RNA提取及基因芯片分析、基因表達譜的生物信息學(xué)分析

小鼠乳腺組織RNA提取方法使用EASYspin Plus 組織/細胞RNA快速提取試劑盒（RN2802，Aidlab，北京）進行總RNA提取和純化。使用Agilent Bioanalyzer 2100生物芯片分析系統(tǒng)和mouse oligo microarray雜交試驗完成芯片雜交試驗，結(jié)果采用GenePix4.1軟件進行分析，連鎖層次聚類使用R軟件heatmap.2包生成。隨后基于DAVID這一基因功能注釋數(shù)據(jù)庫進行Gene Ontology分析[7-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEHP暴露影響孕鼠乳腺的早期發(fā)育

為研究在小鼠青春期發(fā)育過程中DEHP暴露對其乳腺發(fā)育的影響，DEHP處理見栓母鼠在見栓后的第3.5d和第7.5d處死孕鼠，解剖其乳腺，取其第4對乳腺，分析DEHP暴露對孕鼠乳腺發(fā)育的影響情況。結(jié)果如下。

圖1 DEHP暴露刺激CD-1小鼠妊娠早期的乳腺發(fā)育

（A）乳腺組織的整體結(jié)構(gòu)圖片；（B）和（C）在小鼠妊娠的第3.5d和第7.5d，相于對照組，不同濃度的DEHP暴露孕鼠后乳腺終端導(dǎo)管的相對數(shù)量。

如圖1B 所示，在3.5d和7.5d時，與對照組相比，經(jīng)不同濃度DEHP暴露后的孕鼠乳腺組織中具有較多的終端導(dǎo)管。另外，不同濃度DEHP處理孕鼠乳腺組織中也具有較多的邊側(cè)分支。對3.5d和7.5d孕鼠乳腺組織中的乳腺導(dǎo)管發(fā)育的相對數(shù)量進行了定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在3.5d時，與對照組孕鼠乳腺相比，2兩個不同濃度的DEHP處理組孕鼠乳腺的終端導(dǎo)管數(shù)量顯著增加（P＜0.05），分別是對照組的1.43±0.09和1.47±0.11倍（圖1B）。 在7.5 dpc時，DEHP處理組孕鼠乳腺的終端導(dǎo)管數(shù)量相對于對照組同樣顯著（P＜0.05），分別是對照組的1.20±0.10和1.46±0.13(圖1C)。

2.2 DEHP暴露影響孕鼠乳腺細胞的基因表達模式

為了進一步研究DEHP暴露對孕鼠乳腺組織基因表達模式的影響，我們分離了孕鼠乳腺組織并提取了mRNAs進行基因芯片分析。

如圖2A所示，散點圖代表了信號強度富集倍數(shù)的log2比率，黑點代表了對照組和20 μg/kg DEHP處理組乳腺細胞中表達水平相似的基因群，而DEHP處理組中表達上調(diào)的基因標成紅色，下調(diào)的基因標成藍色。研究發(fā)現(xiàn)，總共有25919個基因在孕鼠乳腺細胞中被檢測到，其中25582個基因在對照組和20 μg/kg DEHP處理組之間沒有顯著的表達差異（圖2B）。相對于對照組，20 μg/kg DEHP處理組有152個基因表達水平顯著上調(diào)，185個基因表達水平顯著下調(diào)（圖2B）。表達水平顯著變化的337個差異表達基因的層次聚類分析見圖2 C。

圖2 DEHP暴露孕鼠乳腺組織的基因表達的芯片分析結(jié)果

(A)基于基因表達的微陣列數(shù)據(jù)，DEHP實驗組與對照組間基因表達總體模式類似，DEHP處理后上調(diào)基因用紅色表示，下調(diào)基因用藍色表示 (B) 韋恩圖結(jié)果顯示25582個基因在兩組間表達無差異(log|fold change| ＜ 1), 在DEHP處理組中共有152個上調(diào)及185個下調(diào)顯著差異表達基因。(C) 組間差異表達基因的層次聚類分析。

3 討論

環(huán)境中的雌激素類似物可影響動物的乳腺發(fā)育和健康[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)短時間、低濃度DEHP暴露可以導(dǎo)致孕鼠乳腺早期發(fā)育的基因表達模式的改變，存在潛在的乳腺癌細胞產(chǎn)生的可能性。由此證實了DEHP暴露對孕鼠乳腺細胞發(fā)育的潛在危害和影響。目前的研究表明人尿液中的DEHP的平均含量也達到2 mg/day。FDA認為DEHP對成人來說的安全劑量上限是0.04 mg/day/kg，即50公斤體重的成年人每天吸收2mg DEHP是安全的。但本實驗的研究發(fā)現(xiàn)短期、低劑量接觸DEHP即可對孕鼠乳腺的發(fā)育產(chǎn)生危害，也證明了短期、低劑量DEHP完全可以影響孕鼠乳腺細胞的基因表達模式。

現(xiàn)有的研究表明，EEs及類似物危害乳腺發(fā)育并誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生的潛在作用被廣泛研究[9]。在懷孕期間接觸EEs及其類似物會導(dǎo)致其后代乳腺癌的發(fā)病率升高。Paulose等人的研究表明在胎兒時期接觸BPA會導(dǎo)致其成年后發(fā)生乳腺癌[9]。同樣Acevedo的研究也表明僅在孕期和哺乳期暴露BPA也會誘發(fā)乳腺癌[10]。由此表明BPA可能是一種致癌劑。Dairkee 等人發(fā)展了一個系統(tǒng)培養(yǎng)人類非腫瘤的高危供體乳腺上皮細胞（human non-cancerous high-risk donor breast epithelial cells，HRBECs），發(fā)現(xiàn)BPA影響調(diào)控該細胞存活、增殖和凋亡的多個檢測點的基因表達[11]。Bhan 等人的研究表明，BPA和DES暴露導(dǎo)致人乳腺癌細胞（MCF7）和大鼠乳腺細胞的基因表達發(fā)生改變，并且改變了Hotair基因啟動子區(qū)的表觀修飾模式，導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂[12]。而本研究表明DEHP暴露導(dǎo)致妊娠早期孕鼠乳腺組織中終端導(dǎo)管數(shù)量顯著增加、乳腺過快發(fā)育，也驗證了前期個學(xué)者的研究。

[1] Kavlock R, Boekelheide K, Chapin R, 等. NTP Center for the Evaluation of Risks to Human Reproduction: phthalates expert panel report on the reproductive and developmental toxicity of di-n-octyl phthalate[J]. Reprod Toxicol, 2002,(16):721-734.

[2] Richter CA, Birnbaum LS, Farabollini F, 等. In vivo effects of bisphenol A in laboratory rodent studies[J]. Reprod Toxicol, 2007,24(2):199-224.

[3] Chao HH, Zhang XF, Chen B, 等. Bisphenol A exposure modifies methylation of imprinted genes in mouse oocytes via the estrogen receptor signaling pathway[J]. Histochem Cell Biol, 2012,(137):249-259.

[4] Zhang XF, Zhang LJ, Li L, 等. Diethylhexyl phthalate exposure impairs follicular development and affects oocyte maturation in the mouse[J]. Environ Mol Mutagen, 2013, (54):354-361.

[5] Lamartiniere CA, Jenkins S, Betancourt AM, 等. Exposure to the endocrine disruptor Bisphenol A alters susceptibility for mammary cancer[J]. Horm Mol Biol Clin Investig, 2011,(5): 45-52.

[6] Ayyanan A, Laribi O, Schuepbach-Mallepell S, 等.Perinatal exposure to bisphenol A increases adult mammary gland progesterone response and cell number[J].Mol Endocrinol, 2011, (25): 1915-1923.

[7] Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources[J]. Nature Protoc,2009,(4): 44-57.

[8] Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists[J].Nucleic Acids Res, 2009, (37):1-13.

[9] Paulose T, Speroni L, Sonnenschein C, 等. Estrogens in the wrong place at the wrong time: Fetal BPA exposure and mammary cancer[J]. Reprod Toxicol, 2015,(54):58-65.

[10] Acevedo N, Davis B, Schaeberle CM, 等. Perinatally administered bisphenol A as a potential mammary gland carcinogen in rats[J]. Environ Health Perspect, 2013, (121):1040-1046.

[11] Dairkee SH, Luciani-Torres MG, Moore DH, 等.Bisphenol-A-induced inactivation of the p53 axis underlying deregulation of proliferation kinetics, and cell death in non-malignant human breast epithelial cells[J].Carcinogenesis,2013, (34):703-712.

[12] Bhan A, Hussain I, Ansari KI,等.Bisphenol-A and diethylstilbestrol exposure induces the expression of breast cancer associated long noncoding RNA HOTAIR in vitro and in vivo. J Steroid Biochem Mol Biol, 2014,(141):160-170.

項目來源：武漢輕工大學(xué)校立項目（2016y30）

韋璇（1994-），男，專業(yè)：生物技術(shù)。

鄢又玉（1975-），女，博士，講師。