王海霞，陳 園，王 超，黎 琪，陳 新，張曉琳

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院， 湖北 武漢 430023；2.國家糧食局科學研究院，北京 100037)

多殺菌素(spinosad)，是由土壤放線菌刺糖多孢菌(saccharopolysporaspinosa)在有氧條件下發(fā)酵生成的胞內次級代謝產物，具有殺蟲活性高、殺蟲譜廣、對非靶標動物安全等優(yōu)點[1-2]，是唯一由美國環(huán)保署(US Environmental Protection Agency)于1999、2008和2010年先后3次被授予“總統(tǒng)綠色化學品挑戰(zhàn)獎”(The US-EPA Presidential Green Chemistry Challenge Award)的殺蟲劑[3]。多殺菌素已在20多個國家的2百多種作物上完成登記注冊，我國已經登記注冊的多殺菌素產品有Success?(菜喜，多殺菌素含量為2.5%)和Tracer?(催殺，多殺菌素含量為48%)[4-5]。目前多殺菌素的生產被美國陶氏益農公司(Dow AgroSciences)獨家壟斷，國內適合多殺菌素生產的工業(yè)化菌種及發(fā)酵生產工藝尚未見報道。因此，快速有效地提高多殺菌素的產量以達到工業(yè)化生產意義重大。

經過近十年的研究，人們對多殺菌素的結構性質、理化性質、生物合成途徑等都有了較深入的研究。由于刺糖多孢菌的遺傳背景復雜，分子生物學改造困難，常規(guī)選育方法仍然是獲得高產菌株的有效手段[6]。但傳統(tǒng)誘變育種高產頻率極低，產量提高幅度小，篩選過程中的實驗誤差會抵消變異株產量提高的幅度，另外篩選工作量大，周期長，如果篩選方法不合理、不科學，篩選工作成效將很小[7]。抗生素抗性篩選是基于微生物對抗生素產生耐藥性發(fā)展起來的菌株選育改良技術，它具有易操作、無需特殊設備、不需要菌株遺傳背景知識且效果顯著等特點[8]。國內外研究者圍繞著抗生素抗性篩選技術選育抗生素高產菌株進行了大量相關研究，如HU H F和OCHI K[9]向天藍色鏈霉菌A3中引入鏈霉素、慶大霉素和利福平的3種抗性，獲得的抗性突變株放線紫紅素的產量是野生株的48倍；HU H F[10]等人向變鉛青鏈霉菌66的rpoB基因中引入利福平抗性突變，結果變鉛青鏈霉菌66放線紫紅素(Act)、十一烷基靈紅菌素(Red)和鈣依賴性抗生素(CDA)的生物合成被大幅激活，這些抗生素在變鉛青鏈霉菌66引入抗性突變前是不產生或者產生極少的。本研究采用抗生素抗性篩選技術選育多殺菌素高產菌，通過在不同濃度梯度的鏈霉素(streptomycin，Str)、慶大霉素(gentamicin，Gen)、利福平(rifampicin，Rif)和氯霉素(chlorampenicol，Chl)平板上對刺糖多孢菌進行逐級抗性篩選，比較多殺菌素的發(fā)酵產量，以確認組合抗性篩選技術在選育多殺菌素高產菌株上的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌種

出發(fā)菌株S.spinosaASAGF W2由國家糧食局科學研究院發(fā)酵生物技術實驗室篩選和保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面和平板培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，酪蛋白胨0.25 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.2。

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖15.0 g/L，可溶性淀粉10.0 g/L，豆餅粉3.0 g/L，棉籽蛋白3.0 g/L，大豆蛋白胨25.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.0 g/L，pH 7.2。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60.0 g/L，棉籽蛋白20.0 g/L，NaCl 3.0 g/L，K2HPO4·3H2O 0.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCO31.0 g/L，pH 7.2。

上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌25 min。

1.3 主要試劑和儀器設備

CH3CN和CH3OH(色譜純)：德國Merck公司；spinosad標準品(純度為98%)：美國Sigma公司；鏈霉素、慶大霉素、氯霉素和利福平：生工生物工程(上海)股份有限公司。

SEM-X瑞士科耐搖床：瑞士阿道夫科耐公司；HPS-400生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；Eppendorf AG 22331 Hamburg型離心機：德國Eppendorf公司；Waters 515/2487型高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.4 S.spinosa的抗性篩選

1.4.1 孢子懸液的制備

取一支培養(yǎng)成熟的刺糖多孢菌新鮮斜面，用無菌水洗下孢子，濾除菌絲體，調整孢子濃度為108個/mL，孢子萌發(fā)備用。

1.4.2 最小抑制濃度(MIC)的測定

將高產菌株的孢子懸液涂布于不同濃度的抗生素平板，置于29 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 d，抗生素平板設計如表1所示。以不含抗生素平板上的菌落生長情況為對照，顯著抑制菌落生長的抗生素最低濃度為最小抑制濃度(MIC)。

表1 抗生素濃度梯度 μg/mL

1.4.3 抗生素抗性篩選濃度的確定

郭衛(wèi)寰[11]等人在實驗中發(fā)現在自發(fā)突變情況下抗生素濃度大于最小抑制濃度很難有單菌落生長，即使處于最小抑制濃度下也鮮有單菌落生長。且在本次研究中發(fā)現，利福平和氯霉素對刺糖多孢菌的菌落形態(tài)改變較大，當分別達到最小抑制濃度時，菌落小、形態(tài)不規(guī)則且孢子不豐富，因此，本研究以不含抗生素平板上的菌落形態(tài)和數量為對照，抗生素的篩選濃度設計為有顯著抑制作用且菌落形態(tài)良好的劑量濃度，抗生素濃度梯度如表2所示。

表2 抗生素抗性篩選濃度 μg/mL

1.4.4 抗生素抗性篩選方法

采用2種途徑向出發(fā)菌株ASAGF W2引入低濃度鏈霉素、慶大霉素、利福平和氯霉素4種抗生素的抗性，流程如圖1所示。途徑一是將4種抗生素的抗性通過含有抗生素的平板逐級引入，標記為非GYM組；由于純培養(yǎng)和純種是決定突變效果的關鍵[12]，因而途徑二是將分離的抗性突變株經純培養(yǎng)之后通過抗生素平板引入下一種抗性，標記為GYM組，利用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)進行多殺菌素高產菌株的選育。

圖1 抗生素抗性篩選流程圖

1.5 多殺菌素的HPLC檢測

取一定體積發(fā)酵液，加入2倍體積的甲醇，振蕩30 s后靜置30 min，5 600×g離心20 min，取上清液進行HPLC分析，分析條件為C18反相柱(ZORBAX EcllipeXDB-C18，4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10(含0.05%乙酸銨)，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長244 nm。多殺菌素的主要活性成分是A組分 spinosyn A(85%～90%)和 D組分 spinosynD(10%～15%)[13]，根據多殺菌素A和D組分的積分面積，參照標準品計算其質量濃度，A和D組分之和即為多殺菌素發(fā)酵產量。

1.6 突變株遺傳穩(wěn)定性驗證

將初篩選出的高產突變菌進行搖瓶產量驗證，連續(xù)轉接5次，驗證突變菌的遺傳穩(wěn)定性。

1.7 數據處理

采用Origin 8.6和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行比較處理和顯著性分析。在系統(tǒng)誤差存在的條件下，初篩突變菌發(fā)酵產量是出發(fā)菌株110%以上的菌株統(tǒng)計為正突變菌；發(fā)酵產量是出發(fā)菌株產量90%以下的菌株統(tǒng)計為負突變菌。計算公式為：

正(負)突變率=正(負)突變菌株數/初篩總菌株數×100%

(1)

RVP=P/CP×100%

(2)

公式(2)中RVP為初篩發(fā)酵產量相對值，P為初篩抗性突變菌的發(fā)酵產量，CP為出發(fā)菌株ASAGF W2發(fā)酵產量。

2 結果與分析

2.1 最小抑制濃度的確定

取一定量的ASAGF W2孢子懸液，涂布于不同濃度的抗性平板，獲得鏈霉素、慶大霉素、利福平、氯霉素對ASAGF W2的最小抑制濃度分別為0.5、10、500、2.5 μg/mL，如表3～表6所示。

表3 不同濃度鏈霉素對ASAGF W2菌落生長的抑制作用

注：“+”代表菌落數目的多少；“-”代表菌落數量非常稀少，約0～5個/平板。下同。

表4 不同濃度的慶大霉素對ASAGF W2的抑制作用

表5 不同濃度的利福平對ASAGF W2的抑制作用

表6 不同濃度氯霉素對ASAGF W2菌落生長的抑制作用

2.2 不同抗生素組合對S.spinosa合成多殺菌素的影響

本研究以4種抗生素最小抑制濃度為依據，每種抗生素設立2個篩選濃度，通過構建抗生素種類、濃度以及抗性引入順序多樣性的篩選組合進行實驗設計，探索其對S.spinosa的多重抗性篩選效果?？剐酝蛔兙姆蛛x以抗生素平板上菌落的數目(10～20個)和菌落形態(tài)多樣化為選擇依據，實驗中在非GYM組和GYM組各獲得3條抗生素組合鏈，分別為A1、A2、A3和B1、B2、B3，共分離得到突變菌714株，結果如表7和圖2所示。

表7 抗生素篩選組合結果統(tǒng)計

注：抗生素組合Aa中A表示抗生素種類，a表示抗生素的篩選濃度，單位為μg/mL，如Str0.5Gen10Rif200Chl1表示通過0.5 μg/mL鏈霉素平板、10 μg/mL慶大霉素平板、200 μg/mL利福平平板、1 μg/mL氯霉素平板逐級向出發(fā)菌株ASAGF W2引入對應的抗生素抗性。

1～12為非GYM組篩選組合，13～24為GYM組篩選組合。圖2 不同抗生素組合的正負突變率

結果如圖2所示，抗性篩選產生正突變率的抗生素組合共有16個，其中來源于編號17(Chl1Gen10Rif200Str0.5，GYM組)的4重抗性篩選正突變率最高，為50%；經過5輪復篩獲得的1株遺傳性狀穩(wěn)定的高產突變株來源于編號4(Str0.5Gen10，非GYM組)，產量比出發(fā)菌株提高了23.87%；由表7和圖2可看出編號為5、7、8、16、19、20、22和24的抗生素組合正突變率為0，編號20(Str0.5Gen10Rif200Chl1，GYM組)出現了11.11%的負突變率，且經過搖瓶發(fā)酵檢測出的RVP最高值是108.82%，考慮實驗誤差因素，說明這8個抗生素組合對S.spinosa的產多殺菌素能力無明顯的促進作用。

2.3 比較GYM組和非GYM組對S.spinosa發(fā)酵性能的影響

將GYM組和非GYM組中對應相同的抗生素組合進行統(tǒng)計，以每個組合分離出的突變菌的RVP值作為比較對象，以發(fā)酵的菌株數為樣本量，應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，結果如表8所示。只有Str0.5Gen10Rif200的最高RVP值差異顯著(P<0.05)，Str0.5Rif200Chl1Gen10的RVP值處于差異性不顯著的臨界(P=0.063>0.05)，其余5個組合的RVP值差異性不顯著(P>0.05)。

表8 GYM組和非GYM組抗性突變株發(fā)酵性能的比較

注：用比較均值中的獨立樣本T檢驗法進行兩組數據比較。每行標有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

以抗生素組合對S.spinosa產多殺菌素的作用效果為依據，由表7和圖2可知，有顯著性差異的抗生素組合Str0.5Gen10Rif200在非GYM組和GYM組兩種方法中的RVP最高值分別為120.86%和105.35%，正突變率分別為27.27%和0，可見非GYM組方法中的抗生素組合Str0.5Gen10Rif200對S.spinosa產多殺菌素的作用效果更顯著。

從育種速率上進行比較發(fā)現，以抗生素組合Str0.5Gen10Rif200為例，GYM組和非GYM組2種方法完成3重抗性篩選，前者所需時間是后者的1.7倍。因此，非GYM組是較適的抗生素抗性篩選方法。

2.4 高產突變株的篩選及穩(wěn)定性驗證

將出發(fā)菌株ASAGF W2進行抗生素抗性篩選，初篩共獲得發(fā)生正突變的35株突變菌，結果如表9所示，由于突變體在傳代中可能出現表型延遲現象，導致篩選到的高產菌株轉接后發(fā)酵產量降低，因此，對初篩獲得的35株高產突變菌連續(xù)轉接5次進行遺傳穩(wěn)定性驗證，結果如圖3所示，獲得4株多殺菌素發(fā)酵產量較出發(fā)菌株平均提高13%以上的突變菌，其中突變株13-8-1來源于非GYM組Str0.5Gen10的雙重抗性篩選，多殺菌素平均發(fā)酵產量較出發(fā)菌株ASAGF W2提高了23.87%。連續(xù)轉接5次，菌株13-8-1、I-8-1、I-8-3、F-24-1發(fā)酵產量提升值的標準偏差分別為1.22%、0.83%、1.44%、1.57%，組內個體間的離散程度總體在2%以內。結果表明，篩選獲得4株遺傳穩(wěn)定的高產突變菌。

表9 高產突變菌搖瓶初篩發(fā)酵產量

圖3 搖瓶復篩驗證遺傳穩(wěn)定性

2.5 高產突變菌和出發(fā)菌株發(fā)酵性能的比較

為了進一步研究高產突變菌的特性，本實驗將突變菌13-8-1和出發(fā)菌株ASAGF W2在同一發(fā)酵時間內生物量、葡萄糖消耗以及多殺菌素產量做比值，并以此為縱坐標進行曲線分析，結果如圖4所示。

圖4 突變菌13-8-1和出發(fā)菌株ASAGF W2發(fā)酵性能的比較曲線

根據圖4分析發(fā)現，在發(fā)酵初期(第1～2 d)和發(fā)酵后期(第5～7 d)，突變菌13-8-1生長速度優(yōu)于出發(fā)菌株ASAGF W2，生物量增加至出發(fā)菌株的110%以上。

從2株菌的代謝曲線可知，生物量增長與多殺菌素的合成為半偶聯(lián)型。具體表現在：從發(fā)酵中期開始(發(fā)酵第3 d)，突變株13-8-1的多殺菌素發(fā)酵產量迅速增加并在發(fā)酵第4 d超越出發(fā)菌株ASAGF W2；在發(fā)酵后期，發(fā)酵產量相對值從104%上升至123%，突變株13-8-1表現出更加優(yōu)越的產多殺菌素的能力。由以上推斷突變株13-8-1的生長整體呈現出二次生長的現象，在發(fā)酵初期調整期較短，較快進入對數生長期，生物量迅速增加，進入穩(wěn)定期后開始大量產生次級代謝產物多殺菌素。據此推測，在菌株二次生長過程中，提供充足的營養(yǎng)物質，增加菌體的生物量，并延長菌體生長穩(wěn)定期，可能會進一步提高多殺菌素的產量。

此外，pH的變化和葡萄糖的消耗也反映出發(fā)酵液中菌絲體的生長和多殺菌素的生產周期。影響發(fā)酵液pH有2個因素：一是葡萄糖等營養(yǎng)物質快速被消耗，發(fā)酵液pH降低；二是氮源物質的利用及營養(yǎng)物質匱乏時菌體發(fā)生自溶會導致溶液中氨離子釋放，發(fā)酵液pH升高。在整個發(fā)酵過程中，突變株13-8-1較出發(fā)菌株ASAGF W2耗糖速率慢，且前者的發(fā)酵液pH相較后者高。由此可推斷突變菌 13-8-1對于碳源和氮源營養(yǎng)物質的利用較均衡，有利于菌體生物量的增加和多殺菌素的合成。

3 結論

本研究考察了組合抗生素抗性篩選對S.spinosa產多殺菌素的作用效果，結果顯示抗性篩選技術能夠使菌株的遺傳性狀發(fā)生改變，抗生素篩選組合的正突變率與高產性狀及其穩(wěn)定性無明顯的相關性。本研究對初篩獲得的35株高產突變菌經過復篩驗證，最終獲取4株遺傳穩(wěn)定的高產突變菌。將抗生素抗性篩選應用于刺糖多孢菌的選育是一種簡單易行且效果顯著的方法。

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