單長松，劉 錦，趙子彤，賈朝爽，楊 藝，劉 娟，吳 澎

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.蘇州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，江蘇 蘇州 215123)

紅薯又名白薯、甘薯、地瓜、番薯、山芋等，為旋花科一年生或多年生植物[1]，歷史悠久，在中國大部分地區(qū)都有種植，種植面積大、產(chǎn)量高，資源豐富，是中國4大糧食作物之一[2]。紅薯莖葉富含糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、VC等營養(yǎng)成分，以及黃酮、綠原酸等生物活性成分[3-4],但其作為紅薯產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品一直未得到充分利用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，紅薯莖葉豐富的營養(yǎng)價值和良好的保健作用越來越受到人們重視，其營養(yǎng)與保健作用非常明顯[5-7]。研究表明，綠原酸是植物經(jīng)有氧呼吸過程中的莽草酸途徑所形成的一種苯丙素類化合物，廣泛存在于植物的莖、葉、花等部位，具有抗菌消炎、清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、增加白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能[8-10]，是許多中草藥及中成藥的主要成分。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對紅薯莖葉中的綠原酸、黃酮類等物質(zhì)的研究，主要集中在黃酮類物質(zhì)的抗氧化及綠原酸的抗菌消炎功效等方面[11-13]，對提取工藝的研究也有報道，主要使用乙醇回流浸提法和超聲波輔助水提法[14-17]，均取得了一定的效果。提取工藝中使用超聲波，可以利用其空化作用使原料局部高溫或高壓，加快浸提中固—液2相間的傳質(zhì)速率，達(dá)到提高提取率的目的，近年來被廣泛應(yīng)用于植物中天然產(chǎn)物的提取工藝[18-21]。本研究以紅薯莖葉為原料，以乙醇為浸提液，使用響應(yīng)面法對紅薯莖葉中綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為紅薯莖葉綠原酸提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅薯莖葉：采自山東泰安，洗凈晾干，60 ℃烘干24 h，取烘干后的樣品粉碎過80目篩。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)：Sigma-Aldrich公司。無水乙醇(分析純)：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JA2003A電子天平：上海精密儀器有限公司；UV8000紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；BRANSON-B2510E超聲波清洗機(jī)：美國艾默生電氣集團(tuán)必能信公司；HERMLE-Z206-A離心機(jī)：德國哈默公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用無水乙醇溶解，并定容于25 mL容量瓶中，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)。用移液槍準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5 mL分別于6只25 mL容量瓶內(nèi)，用無水乙醇定容。在322 nm處測定其吸光度值，每組實驗平行測定3次，取平均值。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

1.2.2 樣品綠原酸含量的測定

綠原酸經(jīng)提取后，置于離心管中，以3 000 r/min離心10 min，將上清液定容至100 mL容量瓶中。準(zhǔn)確量取1 mL溶液定容于25 mL容量瓶中，于322 nm處測定樣品吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸的濃度，然后根據(jù)公式(1)計算綠原酸得率，每組平行測定3次，取平均值。

(1)

式(1)中：α為綠原酸得率，mg/g；C為樣品中綠原酸濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為紅薯莖葉干粉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計

在張冕等[15]的研究基礎(chǔ)上，以50%乙醇溶液為溶劑，料液比為1∶35，超聲功率500 W，提取溫度50 ℃，分別將提取時間設(shè)為10、15、20、25、30 min，考察提取時間對綠原酸提取率的影響。

提取時間25 min，料液比1∶35，超聲功率500 W，提取溫度分別為35、45、55、65、75 ℃，考察提取溫度對綠原酸提取率的影響。

提取時間25 min，超聲功率500 W，提取溫度65 ℃，設(shè)置料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，考察料液比對綠原酸提取率的影響。

提取時間設(shè)為25 min，料液比1:35，提取溫度65 ℃，設(shè)置乙醇濃度分別為35%、45%、55%、65%、75%，考察乙醇濃度對綠原酸提取率的影響。

每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其擬合的直線方程為：y=0.027 44x+0.003 48，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，表明綠原酸在0～20 μg/mL范圍內(nèi)與吸光值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，加入50%乙醇35 mL，使料液比為1∶35 g/mL，在微波功率500 W、提取溫度50 ℃條件下，研究提取時間分別為10、15、20、25、30 min對紅薯莖葉綠原酸得率的影響，每組實驗重復(fù)測定3次。結(jié)果如圖2所示，微波提取時間從10 min延長到25 min的過程中，綠原酸得率逐漸增大，這可能是由于隨著時間的延長，在微波輔助條件下，綠原酸逐漸從紅薯莖葉中擴(kuò)散至浸提液中，綠原酸得率逐漸增大；當(dāng)提取時間為25 min時，綠原酸的得率達(dá)到最大值；此后隨著提取時間的繼續(xù)延長，得率呈下降趨勢。提取時間的延長可以促進(jìn)紅薯莖葉中綠原酸更好地溶出，使溶出更加完全，但是過長的提取時間可能會使溶出的綠原酸被氧化或被分解從而導(dǎo)致得率下降。因此，選擇浸提時間為25 min。

圖2 提取時間對綠原酸得率的影響

2.2.2 提取溫度對綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，加入50%乙醇35 mL，使料液比為1∶35 g/mL，在微波功率為500 W、提取時間為25 min的條件下，研究提取溫度(35、45、55、65、75 ℃)對紅薯莖葉綠原酸得率的影響，每組實驗重復(fù)測定3次。結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，在一定溫度范圍內(nèi)，綠原酸的得率隨提取溫度的升高而提高。這與綠原酸的溶解性有關(guān)，低溫條件不利于綠原酸的溶出，隨著溫度的升高綠原酸溶解性逐漸增強(qiáng)，浸提液中的分子運動速率也逐漸加快，紅薯莖葉與乙醇的傳質(zhì)作用得到加強(qiáng)[24]，綠原酸的得率逐漸升高。當(dāng)溫度為65 ℃時，綠原酸得率達(dá)到最大，之后，綠原酸得率隨溫度的升高呈現(xiàn)降低趨勢。綠原酸本身不穩(wěn)定，提取時高溫條件會加速綠原酸的分解，并使其有效成分被破壞，綠原酸失活，從而使綠原酸的得率降低[18]。因此，本研究選擇的提取溫度為65 ℃。

圖3 提取溫度對綠原酸得率的影響

2.2.3 料液比對綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，微波功率500 W，在提取時間為25 min、提取溫度為65 ℃的條件下，通過向各組樣品中加入不同體積的50%乙醇控制料液比，研究料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對紅薯莖葉綠原酸得率的影響。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)料液比為1:35 g/mL時，綠原酸的得率達(dá)到峰值，之后再繼續(xù)增大乙醇溶液體積時，綠原酸得率下降，說明在一定范圍內(nèi)增大乙醇溶液的用量有利于綠原酸的萃取，當(dāng)料液比達(dá)到一定值時，紅薯莖葉中的綠原酸的溶出量達(dá)到最大值，此后隨著乙醇溶液用量的增大，得率反而下降。這是由于乙醇溶液用量增大導(dǎo)致底物濃度減小，使分子間碰撞機(jī)會減少，從而使得率有所下降，此外，過大的溶劑用量也會造成資源浪費，增加后續(xù)處理的困難。因此，選擇料液比為1∶35 g/mL。

圖4 料液比對綠原酸得率的影響

2.2.4 乙醇濃度對綠原酸得率的影響

準(zhǔn)確稱取紅薯莖葉粉末(80目)1.000 g，在微波功率500 W、提取溫度65 ℃條件下提取25 min，向各組樣品中加入相同體積不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，使料液比為1∶35 g/mL，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%、45%、55%、65%、75%)對紅薯莖葉綠原酸得率的影響，每組實驗重復(fù)測定3次，結(jié)果如圖6所示。由圖5可以看出，綠原酸得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈先增大后減小的趨勢，這是由不同濃度的乙醇溶液解吸紅薯莖葉細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)能力不同造成的[27]；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%時，紅薯莖葉中綠原酸的得率最高，提取效果最佳。當(dāng)乙醇的濃度相對較高時，會使紅薯莖葉細(xì)胞中其它醇溶性物質(zhì)溶出的比例增多，造成有效成分所占比例減少，因此，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)大于45%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加綠原酸的得率逐漸下降。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%用于提取綠原酸。

圖5 乙醇濃度對綠原酸得率的影響

2.3 工藝優(yōu)化實驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取影響綠原酸得率的4個主要因素，即提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度，采用Box-Behnken實驗設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面分析。每個因素取3個水平，分別以1、0、-1編碼，使用Design-Expert 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而確定紅薯莖葉綠原酸提取的最佳工藝參數(shù)。實驗自變量因素編碼及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.4 響應(yīng)面實驗優(yōu)化

響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及實驗結(jié)果

續(xù)表2

實驗號ABCD綠原酸得率/(mg/g)14-10-103．27271501013．123416-100-13．123317100-13．2557180-10-13．16581900003．4724200-1-103．1617210-1103．12782210103．24842300003．533124-11003．19002501-103．0976261-1003．22032700003．52132800003．329029-1-1003．1737

應(yīng)用Design Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到紅薯莖葉中綠原酸的得率與各因素的二次方程模型：

綠原酸得率:

R1=3.46+9.392×10-3A-2.1×10-3B-2.2×10-2C-4.167×10-4D+1.2×10-2AB+3.5×10-2-4.3×10-2AD-1.2×10-2BC-1.1×10-2BD-2.175×10-3CD-1.1×10-1A2-1.8×10-1B2-1.4×10-1C2-1.4×10-1D2

對表2中的實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，方差分析結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

注：*表示顯著(P<0.05)。

由表3可知，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值的主次順序為C>B>A>D，其因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.855 2)，當(dāng)P<0.05時表示該指標(biāo)顯著，回歸方差分析結(jié)果表明，整體模型的P=0.001 2<0.05，說明該二次方程模型達(dá)到顯著水平；失擬項P=0.778 0>0.05，不顯著，說明該方程擬合較好，回歸方程能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，該模型可用于紅薯莖葉中綠原酸提取的最佳工藝條件的確定。

2.5 響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)值和各實驗因子構(gòu)成的立體曲面圖如圖6所示，顯示了提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度中任意2個變量取0水平時，其余2個變量對紅薯莖葉中綠原酸提取率的影響。等高線圖中同一橢圓區(qū)域內(nèi)，綠原酸提取率是相同的，橢圓中心點為綠原酸提取率最高的點；由中心點向外緣延伸，綠原酸提取率逐漸減少。等高線的形狀可以反映實驗因子交互影響響應(yīng)值的強(qiáng)弱，形狀越接近圓形則交互作用越不顯著。

圖6 各因素交互作用對綠原酸提取率影響的響應(yīng)曲面

圖6a、圖6b、圖6c和圖6e中等高線的形狀較圖6d和圖6f中的等高線的形狀更趨于橢圓，因此提取時間與提取溫度、提取時間與料液比、提取時間與乙醇濃度、提取溫度與乙醇濃度的交互作用對紅薯莖葉中綠原酸提取率的影響比提取溫度與料液比、料液比與乙醇濃度2因素的交互作用更顯著。

2.6 驗證實驗

用Design Expert軟件進(jìn)行理論最佳工藝條件優(yōu)化，結(jié)果為：提取時間為25.17 min，提取溫度為64.43 ℃，料液比為1∶34.6，乙醇濃度為44.97%，在此最佳工藝條件下紅薯莖葉中綠原酸的理論得率為3.460 6 mg/g。為驗證該方法的可靠性，采用最優(yōu)提取條件對紅薯莖葉中綠原酸進(jìn)行3次平行提取實驗，為了便于操作，將最佳提取工藝條件修正為提取時間為25 min、提取溫度為64.5 ℃、料液比為1∶35 g/mL、乙醇濃度為45%，在此條件下綠原酸的實際得率為3.442 1 mg/g，與預(yù)測值基本一致。表明該模型可以較好地預(yù)測紅薯莖葉中綠原酸的提取率。

3 結(jié)論

采用Design-Expert軟件的Box-Behnken方法設(shè)計響應(yīng)面實驗，建立紅薯莖葉中綠原酸提取工藝的二次多項數(shù)學(xué)模型。方差分析結(jié)果表明：紅薯莖葉中綠原酸的提取率與提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度均有一定關(guān)系。結(jié)合響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果和驗證實驗結(jié)果，確定其最佳工藝參數(shù)：提取時間25 min，提取溫度64.5 ℃，料液比1∶35g/mL，乙醇濃度45%，在此條件下得率達(dá)3.442 1 mg/g，與預(yù)測值基本相符。根據(jù)響應(yīng)面分析法得到的紅薯莖葉中綠原酸的提取工藝參數(shù)是真實可靠的。

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