林杰，賴志文，林潔，徐慶，冉旭

(自貢市婦幼保健院遺傳生殖中心，四川自貢643000)

EGR-1及MMP-9在子宮內膜異位癥中的表達及意義

林杰，賴志文，林潔，徐慶，冉旭

(自貢市婦幼保健院遺傳生殖中心，四川自貢643000)

目的研究早期生長反應基因-1(EGR-1)與金屬基質蛋白酶-9(MMP-9)在子宮內膜異位癥患者異位內膜與在位內膜細胞中的表達情況及臨床意義。方法收集45例2014年5月至2015年3月于四川省自貢市婦幼保健院確診的子宮內膜異位癥患者的異位內膜及在位內膜，同期收集30例非子宮內膜異位癥患者的正常內膜組織。通過免疫組化二步法對三種內膜組織中EGR-1、MMP-9的表達情況進行分析。結果EGR-1在子宮內膜異位癥患者異位內膜(84.44%)與在位內膜(73.33%)腺上皮細胞中的陽性檢測率顯著高于正常內膜組(40.0%)，差異有統計學意義(P＜0.05)，但兩者差異無統計學意義(P＞0.05)；而不同內膜間質細胞中EGR-1的陽性檢出率異位內膜為48.89%，在位內膜為44.44%，正常內膜為43.33%，三者比較差異無統計學意義(P＞0.05)；異位內膜和在位內膜腺上皮細胞(在位內膜88.89%、異位內膜64.44%)及間質細胞(在位內膜66.67%、異位內膜42.22%)中MMP-9的陽性檢出率均顯著高于正常內膜組(腺上皮細胞33.33%、間質細胞16.67%)，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)，且異位內膜組顯著高于在位內膜組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論檢測EGR-1、MMP-9的表達可用于判斷子宮內膜異位癥的侵襲轉移和評估預后。

早期生長反應基因-1；金屬基質蛋白酶-9；子宮內膜異位癥；免疫組織化學；表達；臨床意義

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)簡稱內異癥，是一種臨床常見的婦科疾病，但其發(fā)生機制目前仍尚未明確。相關研究表明，子宮內膜隨經血逆流至腹腔，經過粘附、侵襲及形成新生血管等過程提供了異位內膜成長的必要條件。子宮內膜異位癥與惡性腫瘤表型侵襲能力的相似，二者可能存在共有的分子生物學基礎[1]。金屬基質蛋白酶9(matrix metallo proteinase，MMP-9)是金屬基質蛋白酶(matrix metallo Proteinase，MMPS)家族中分子量最大的明膠酶。目前研究認為MMP-9在子宮內膜細胞的異位粘附、種植和生長的過程中發(fā)揮了重要作用[2]。而研究發(fā)現，早期生長反應基因-1 (early growth response gene-1，EGR-1)可上調MMP-9表達，是促進腫瘤細胞粘附和侵蝕的重要轉錄因子[3]，但EGR-1在脫落的內膜細胞種植過程中中是否發(fā)揮同等重要的作用，還有待進一步的確定。本研究旨在探討EGR-1、MMP-9與子宮內膜異位癥發(fā)生及發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料實驗組共采集得到45份異位內膜和在位內膜，采集對象為2014年5月至2015年3月期間在自貢市婦幼保健院婦產科住院手術的患者?；颊吣挲g23～45周歲，平均32.5歲。其中，在位內膜增生期和分泌期患者分別為39例與6例。對照組選取同期在本院因其他原因進行手術治療但子宮內膜正常的30例非EMs患者，年齡31～47周歲，平均37.4歲，其中增生期22例，分泌期8例。EMs與非EMs患者月經周期均表現正常，且近3個月內未使用過任何激素類藥物。同時排除患有多囊卵巢綜合征、甲狀腺疾病、糖尿病等異常情況。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集在手術過程中分別收集卵巢子宮內膜異位囊腫患者的囊壁組織、在位內膜組織及對照組正常子宮內膜，立即進行多聚甲醛固定、石蠟包埋，最終經病理醫(yī)師檢查證實。對于非全子宮切除的患者，需征得知情同意。手術過程中通過取內膜器直接采集患者子宮內膜。

1.2.2 免疫組化檢測本研究采用鏈霉親和素-生物素復合物(strept Avidin-Biotin Complex，SABC)法進行免疫組化分析，EGR-1、MMP-9多克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術公司，SABC三步法試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，具體操作步驟詳見說明書。實驗過程中陽性對照為已知的陽性乳腺癌切片，陰性對照組一抗以PBS代替。

1.2.3 結果評判標準通過雙盲法建立具體的評分標準。每張切片隨機選取10個代表性高倍視野進行觀察，并記錄每個視野下100個細胞中的陽性細胞(細胞內出現黃色顆粒即可判定為陽性細胞)的數量，結果以平均值表示。評分標準及對應關系詳見表1。最終以染色強度和染色細胞所占面積的積分之和作為判別陰性和陽性依據。若積分和為0，則判定記過為陰性(-)；若積分和為1～2，則判定結果為弱陽性(+)；同理，積分和為3～4、5～6分別判定結果為陽性(++)和強陽性(+++)。

表1 染色強度與染色細胞所占面積評分標準

1.3 統計學方法應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用秩和檢驗；EGR-1與MMP-9表達的相關性則采用Spearman相關性分析，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EGR-1在不同子宮內膜組織中的表達如圖1中A、B、C所示，EGR-1由腺細胞和間質細胞的細胞核表達。EGR-1在異位內膜腺細胞中的表達量顯著高于在位內膜和正常內膜腺細胞中的表達，差異有統計學意義(P＜0.05、P＜0.01)，而在位內膜腺細胞中EGR-1的表達量明顯高于在正常內膜腺細胞中的表達，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；不同內膜間質細胞中EGR-1的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。異位內膜和在位內膜中腺上皮細胞EGR-1的表達顯著高于間質細胞中的表達；而正常內膜中間質細胞EGR-1的表達略高于腺上皮細胞，但差異無統計學意義(P＞0.05)。各組中EGR-1的表達統計情況見表2。

圖1 不同子宮內膜組織中EGR-1、MMP-9蛋白免疫組化染色結果(×200)

表2 EGR-1在不同子宮內膜中的表達(例)

2.2 MMP-9在不同內膜組織中的表達如圖1中D、E、F所示，MMP-9的表達分布于腺細胞和間質細胞的胞漿。經過統計學分析發(fā)現，MMP-9在異位內膜腺細胞中的表達量顯著高于在位內膜和正常內膜腺細胞中的表達(P＜0.05、P＜0.01)，而在位內膜腺細胞中MMP-9的表達量明顯高于正常內膜腺細胞，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)；此外，MMP-9在異位內膜間質細胞中的表達量顯著高于在位內膜和正常內膜間質細胞中的表達，差異有統計學意義(P＜0.05、P＜0.01)，而在位內膜間質細胞中MMP-9的表達量明顯高于在正常內膜間質細胞中的表達，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。同一內膜中，MMP-9在腺上皮細胞中的表達量明顯高于間質細胞，差異有統計學意義(P＜0.05)。各組內膜中MMP-9的表達情況見表3。

表3 MMP-9在異位內膜、在位內膜和正常子宮內膜中的表達(例)

2.3 異位內膜、在位內膜中EGR-1、MMP-9表達的相關性異位內膜腺上皮細胞和間質細胞中EGR-1、MMP-9表達的相關系數分別為0.876和0.812(P均＜0.01)。而在位內膜腺上皮細胞和間質細胞中EGR-1、MMP-9表達的相關系數分別為0.969和0.934(P均＜0.01)。二者在異位內膜和在位內膜細胞中的表達均顯著相關。

3 討論

子宮內膜異位癥是一種較常見的婦科疾病，病理表現主要為子宮內膜組織生長于子宮腔外，如子宮肌層、卵巢或盆腔內的其他部位。此外，患者還常伴有月經不調、痛經甚至不孕等癥狀。而目前其發(fā)病機制仍未完全明確，即使是此前較公認的子宮內膜種植學說也無法合理闡釋90%左右婦女在月經來潮時存在經血逆流，EMs的發(fā)生率卻不足15%等臨床表現。近年來，“在位內膜決定論”的觀點被大眾所接受，該理論指出，在位內膜對于EMs的發(fā)生具有關鍵性作用[4]。

EGR-1屬于即刻早期基因家族的一員，可參與細胞的生長、增殖以及凋亡等多種生理過程。其表達受有絲分裂原、生長因子、細胞因子、缺氧、雌激素等因素介導[5]。相關研究表明，EGR-1可參與子宮內膜上皮細胞的增殖[6]。而本研究發(fā)現，EMs患者異位內膜腺上皮細胞中EGR-1的表達量明顯高于正常內膜腺上皮細胞，表明EGR-1在異位內膜中的過高表達可能與異位病灶種植后的生長與發(fā)展相關。而EGR-1在在位內膜與正常內膜之間存在的表達差異，表明在位內膜在經血逆流時可能更容易發(fā)生異位種植。

此外，大量的研究結果表明，依賴于脫落細胞的粘附作用，在足夠的血液供給情況下，脫落的子宮內膜成功粘附并種植在腹膜或組織器官上。本研究推測，受到EGR-1正向調控的MMP-9可以促進血管內皮細胞出芽和新生血管形成，促使異位內膜得以種植生長并不斷擴大，從而在子宮內膜細胞的異位粘附、種植和生長的過程中發(fā)揮了重要作用[7]。本研究發(fā)現，MMP-9在異位內膜腺上皮細胞中表達明顯高于對照組，據此推測異位內膜中MMP-9高表達可提高異位存活能力，并促成病灶的進一步發(fā)展。而在本研究中，MMP-9在在位內膜腺上皮細胞中的表達明顯高于對照組，這與Matsuzaki等[8]研究結果存在一致性，也與“在位內膜決定論”的觀點相近。同時，本研究結果表明子宮內膜異位癥異位內膜腺上皮細胞中MMP-9的表達量顯著高于其在在位內膜腺上皮細胞，分析其原因可能受腹腔微環(huán)境差異的影響，使得缺氧情況在異位內膜中表現更為嚴重，而為適應缺氧的條件，EGR-1正向調控MMP-9表達的機制被激活，從而改善了血管生成的能力[5]。

本研究通過免疫組化法分析了內異癥患者的異位內膜及在位內膜中EGR-1、MMP-9的表達情況。結果表明，EGR-1、MMP-9在異位內膜和在位內膜中的高表達與EMs的發(fā)病機制密切相關，進一步的分析將有助于判斷子宮內膜異位癥的侵襲轉移及評估預后。

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Expression of EGR-1,MMP-9 in endometriosis of ovary and its clinical significance.

LIN Jie,LAI Zhi-wen,LIN Jie,XU Qing,RAN Xu.Department of Genetic and Reproductive Medicine Center,Zigong Municipal Maternal and Child Health Hospital,Zigong 643000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of early growth response gene-1(EGR-1)and matrix metallo proteinase-9(MMP-9)protein in the ectopic and eutopic endometrium in endometriosis(EMs)patients and its clinical significance.MethodsThe expression of EGR-1 and MMP-9 protein in ectopic and entopic endometrium tissues from 45 patients with EMs and endometrium tissues from 30 patients with normal endometrium in Zigong Municipal Maternal and Child Health Hospital from May 2014 to March 2015 were detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive rate of expression of EGR-1 in glandular cell in ectopic(84.44%)or eutopic endometrium(73.33%)of the patients with EMs were significantly higher than that in control group(40.0%)(P＜0.05),but no significant difference between ectopic and eutopic endometrium was found(P＞0.05).There were no significant differences in the positive expression rate of EGR-1 in stromal cells in ectopic endometrium(48.89%),eutopic endometrium(44.44%)or normal endometrium(43.33%)(P＞0.05);The positive expression rate of MMP-9 in glandular and stromal cells in ectopic (glandular cells 88.89%,stromal cells 66.67%)or eutopic endometrium(glandular cells 64.44%,stromal cells 42.22%)of the patients with EMs were significantly higher than those in control group(glandular cells 33.33%,stromal cells 16.67%) (P＜0.01),and the positive expression rate in ectopic endometrium were significantly higher than in that in eutopic endometrium(P＜0.05).ConclusionThe expression of EGR-1 and MMP-9 in ectopic and eutopic endometrium may play an important role in the invasion of endometriosis and metastasis of EMs as well as evaluation of prognosis.

Early growth response gene-1;Matrix metallo proteinase-9;Endometriosis;Immunohistochemistry;Expression;Clinical significance

R711.74

A

1003—6350（2017）07—1101—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.025

2016-10-10)

林杰。E-mail：727064716@qq.com