何風(fēng)雷+鄭華珠+石洪超+李周+王利勝+彭富全+劉敏

[摘要] 目的 建立胃瘍寧丸中芍藥苷的高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定方法。方法 采用甲醇控溫25℃超聲30 min提取芍藥苷，采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱為色譜柱；甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（30∶70）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃。結(jié)果 芍藥苷濃度在5.60～112 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9991），平均加樣回收率為99.04%；7批樣品中芍藥苷含量均值為1.871 mg/g，轉(zhuǎn)移率在62%左右。結(jié)論 本法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性良好，可作為胃瘍寧丸中芍藥苷含量分析方法。

[關(guān)鍵詞] 胃瘍寧丸；芍藥苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）03（c）-0133-04

Determination of Paeoniflorin in Weiyangning Pills by HPLC

HE Fenglei1 ZHENG Huazhu2 SHI Hongchao1 LI Zhou2 WANG Lisheng2 PENG Fuquan1 LIU Min1

1. Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Co. Chenliji， Guangzhou 510288， China； 2.School of Chinese Materia Medica， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China

[Abstract] Objective To establish a determination method of Paeoniflorin in Weiyangning Pills by HPLC. Methods Methanol was used to extract Paeoniflorin at 25℃ for 30 min by the ultrasonic system， Diamonsil C18（250 mm ×4.6 mm， 5 μm） column was used as the column， methanol-0.05 mol/L Potassium dihydrogen phosphate solution （30∶70） was used as the mobile phase， detection wavelength was 230 nm and the flow rate was 1.0 mL/min， and the temperature was 25℃. Results The concentration of Paeoniflorin was linear in the range of 5.60-112 μg/mL， the average recovery was 99.04% （ r = 0.9991）.The average content of Paeoniflorin in the 7 batches of samples were 1.871 mg/g and the transfer rate was about 62%. Conclusion This method is simple， quick and accurate， for the determination of Paeoniflorin in Weiyangning Pills.

[Key words] Weiyangning Pills； Paeoniflorin； HPLC； Content determination

胃瘍寧丸由烏藥、制白術(shù)、炒山藥、白及、青皮、香附、赤芍、高良姜、仙鶴草、甘草、珍珠層粉和五指毛桃等12種藥材組方而成[1]，具有溫中散寒、制酸止血、理氣止痛的功效，常用于治療胃脘脹痛或刺痛、嘔吐泛酸諸癥[2]。現(xiàn)代研究表明，胃瘍寧丸具有抗?jié)?、促進(jìn)胃腸黏膜修復(fù)[3]、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)[4]、抗炎鎮(zhèn)痛[5]、止血[6]、抗幽門螺桿菌[7]等藥理作用，對(duì)胃潰瘍有顯著的療效。方中赤芍味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，赤芍主要含萜類及其苷類、黃酮類及其苷類、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分[8-9]，具有保肝[10]、抗腫瘤[11]、神經(jīng)保護(hù)[12]、降血糖[13]、心臟保護(hù)、抗血小板聚集[14-15]、抗氧化[16]、抗內(nèi)毒素等多種藥理作用。有動(dòng)物試驗(yàn)表明，芍藥苷對(duì)哮喘小鼠的氣道趨化因子及受體具有顯著的抑制作用[17]。芍藥苷是赤芍的主要活性成分之一，故本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定胃瘍寧丸中芍藥苷的含量，以期建立精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好，結(jié)果可靠，可用于胃瘍寧丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定量分析方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器

數(shù)控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200DE型）；Waters 高效液相色譜儀（515泵，2487紫外檢測(cè)器，美國(guó)waters公司）；N3000色譜工作站（浙江大學(xué)）；AUW120電子分析天平（SHIMADZU公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201136，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；赤芍藥材（批號(hào)：140401，廣州至信中藥飲片有限公司）；磷酸二氫鉀（色譜純）；甲醇（色譜純，DIKMA TECHNOLOGIES INC）；水（重蒸餾水，臨用前制備）；成藥樣品（批號(hào)：EQ1221、EK1141、EK1151、C51006、FL1081、FL1061、C51007）由廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司提供；陰性樣品自制。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不低于3000。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液的制備 精密稱取胃瘍寧丸0.5 g，加入2倍量硅藻土研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定重量，控溫25℃超聲處理（功率90 W，頻率50/60 kHz）30 min，放冷，再稱定其重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取2.8 mg芍藥苷對(duì)照品，置10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加甲醇溶解至刻度，搖勻，制成0.28 mg/mL的儲(chǔ)備液。分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL定容至5 mL，配制成不同濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.3對(duì)照藥材溶液的制備 精密稱取赤芍藥材0.1 g，同供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。

2.2.4赤芍陰性對(duì)照溶液的制備 按處方中藥味的比例，配制不含赤芍的群藥，按其工藝制成赤芍陰性對(duì)照樣品，精密稱取0.5 g再按供試品溶液的制備方法制備赤芍陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專屬性考察 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，取芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL，色譜圖見圖1。由圖1可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下，芍藥苷的保留時(shí)間約為11.60 min，芍藥苷與其相鄰峰可達(dá)基線分離。陰性對(duì)照無干擾，胃瘍寧丸中芍藥苷色譜峰與其他組分色譜峰分離度良好。

2.3.2 線性關(guān)系的考察 精密稱取芍藥苷對(duì)照品2.80 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為280 μg/mL的儲(chǔ)備液；分別吸取上述芍藥苷儲(chǔ)備液0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別制成濃度為5.60、22.4、33.6、44.8、56.0、112 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定，重復(fù)3次。以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=19 905X-36 955，r=0.9991。結(jié)果表明芍藥苷濃度在5.60～112 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份對(duì)照品溶液（44.8 μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定芍藥苷各峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（批號(hào)C51007）6份，按“供試品溶液的制備”方法制備樣品溶液。在上述色譜條件下，測(cè)定芍藥苷的峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.12%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次樣品（批號(hào)C51007），分別于0、2、4、8、12、24 h精密吸取10 μL，按“2.1”項(xiàng)下液相色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定芍藥苷峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.309%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取胃瘍寧丸樣品（批號(hào)EK1151）6份，每份精密稱取0.25 g，加入2倍量硅藻土研勻，置具塞錐形瓶中，稱定重量，依次分別每組添加等量芍藥苷對(duì)照品（含芍藥苷0.55 mg），依法制成供試品溶液，按色譜條件測(cè)定，計(jì)算得平均回收率為99.04%，RSD為3.50%，見表1。

表1 芍藥苷的加樣回收率

2.4 樣品含量測(cè)定

取胃瘍寧丸7批，按“2.2.1”項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定各批次供試品芍藥苷含量，見表 2。由表2可知，各批次樣品所用赤芍藥材中芍藥苷平均含量為3.018 mg/g，成品胃瘍寧丸中芍藥苷平均含量為1.871 mg/g，由此計(jì)算所得樣品中芍藥苷轉(zhuǎn)移率在62%左右。表明此提取工藝較優(yōu)，能減少生產(chǎn)成本，提高效益。

表2 樣品芍藥苷含量測(cè)定

3 討論

3.1提取溶劑的考察

芍藥苷的常用提取溶劑有甲醇、50%乙醇和30%乙醇，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)這3種提取溶劑進(jìn)行了考察；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)50%乙醇和30%乙醇超聲提取后提取液過于黏稠，難以濾過，不利于含量測(cè)定，可能與胃瘍寧丸劑中蜂蜜含量較大有關(guān)。高效液相色譜結(jié)果表明，甲醇超聲提取后，樣品中的芍藥苷能得到很好的分離，且操作簡(jiǎn)便，故本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2超聲時(shí)間的確定

超聲提取技術(shù)可以簡(jiǎn)化操作流程，縮短處理時(shí)間，提高分離效率[18]。查閱文獻(xiàn)[19-21]可知，在制劑的芍藥苷含量測(cè)定中超聲提取處理的方法也經(jīng)常使用。因此本文采用超聲提取芍藥苷，并考察最佳超聲時(shí)間。精密稱取胃瘍寧丸0.5 g，加入2倍量硅藻土研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定重量，分別控溫25℃超聲處理（功率90 W，頻率50/60 kHz）15、30、45 min，放冷，再稱定其重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別吸取各樣品10 μL，按“2.1”項(xiàng)下液相色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得芍藥苷含量分別為2.103、2.154、2.149 mg/g，結(jié)果表明超聲30 min之后，樣品溶液中芍藥苷的含量不再增加反而減少，說明超聲30 min已經(jīng)提取完全，故確定樣品的超聲時(shí)間為30 min。

采用甲醇超聲提取30 min可使胃瘍寧丸中芍藥苷較大程度地溶出；樣品中芍藥苷的轉(zhuǎn)移率在62%左右，可能是提取過程中化學(xué)成分發(fā)生變化所致；通過線性考察、精密度試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)等一系列方法學(xué)考察，證明本文建立的高效液相色譜法靈敏度高、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好，可作為胃瘍寧丸中芍藥苷含量測(cè)定的方法。

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（收稿日期：2016-12-20 本文編輯：王 麗）