劉洋+隗麗+李雪蓮+潘孟+王子禹+董玲

[摘要] 藥物藥效的發(fā)揮與其在機體內(nèi)始終處在吸收、分布、代謝、排泄這種動態(tài)變化的過程密不可分，而吸收作為口服藥物進入機體的首要環(huán)節(jié)格外受到重視。中藥作為多成分與多靶點的藥物，單一成分的性質(zhì)與其在多成分環(huán)境中所表現(xiàn)出來的性質(zhì)會有差別。該文以黃連提取物中的生物堿為主要研究對象，建立黃連中生物堿成分含量測定的分析方法。并通過離體翻轉(zhuǎn)腸囊實驗及腸道灌流并行采血實驗初步鎖定黃連水提液中可透過腸壁吸收并吸收入血的成分，為后續(xù)對黃連多成分的吸收代謝研究提供數(shù)據(jù)參考與支持。

[關(guān)鍵詞] 黃連水煎液；多成分；離體法；在體法；中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)

In vitro and in vivo intestinal absorption of Huanglian decoction in

multi-component environment

LIU Yang，WEI Li，LI Xue-lian，PAN Meng，WANG Zi-yu，DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

[Abstract] The effect of drugs in the body is always inseparable with the dynamic processes of absorption， distribution， metabolism and excretion. For oral drug， absorption， as the first link to enter the body， is particularly valued. Traditional Chinese medicine has multiple components and multiple targets， and the nature of its single composition is different from that in the multicomponent environment. Alkaloids in Huanglian extract was used as the main object in this study to establish an analytical method for determining the content of alkaloids in Huanglian. In addition， the compositions of the Huanglian aqueous extract solution which can be absorbed through intestinal wall into blood， were initially determined by the means of everted gut sac and in intestinal perfusion with venous sampling experiment. This paper can provide data reference and support for the further study on the absorption and metabolism of Huanglian.

[Key words] Huanglian decoction； multiple components； in vitro； in vivo；biopharmaceutics classification system of chinese materia medica

中藥多成分多靶點顯效的特點已被廣泛認同，且近年來質(zhì)效關(guān)聯(lián)等理念在中藥質(zhì)量控制方面的應(yīng)用已日漸深入，綜合考慮中藥特點及其臨床療效進行質(zhì)量控制及評價成為研究熱點。藥物藥效的發(fā)揮與其在機體內(nèi)始終處在吸收、分布、代謝、排泄這種動態(tài)變化的過程密不可分，而吸收作為口服藥物進入機體的首要環(huán)節(jié)格外受到重視。根據(jù) BCS 在生物藥劑學研究范圍中指向于藥物吸收的特征，并結(jié)合中藥多成分的復雜性與臨床療效實際，課題組提出的“中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)”（biopharmaceutics classification system of chinese materia medica，CMMBCS）[1]將 BCS 以吸收為核心的分類理念貫徹，并遵循定性為先、定量跟進的研究思路，以吸收與否為界，分別定性與定量研究吸收成分與非吸收成分，并做CMMBCS分類。

在定性研究時，中藥成分的吸收完全是一個動態(tài)過程，首先要在此過程中對要吸收的目標成分進行鎖定，其次再充分考慮多成分環(huán)境下其他成分對目標成分的影響。然后再對吸收成分的吸收程度進行系統(tǒng)分析和定量研究，對可吸收成分的溶解性和腸滲透性數(shù)據(jù)進行科學歸類，并通過建立溶出度和溶解度的關(guān)聯(lián)關(guān)系而完善CMMBCS?；凇岸喑煞謱哟尾町惐容^法”的理論，課題組前期已經(jīng)對葛根芩連方中君藥葛根的主要成分葛根素進行了多成分環(huán)境下的模擬研究[2-3]，及臣藥黃連的主要成分小檗堿在黃連水煎液多成分環(huán)境下的CMMBCS研究[4]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，采用離體法及在體法，深入到中藥整體腸吸收的目標成分鎖定，為多成分環(huán)境對目標成分的影響研究及后續(xù)的CMMBCS分類提供研究基礎(chǔ)，同時也為其他中藥CMMBCS的定性研究提供參考依據(jù)。

黃連在中醫(yī)藥傳統(tǒng)方劑中使用廣泛，《傷寒論》在12方中均用到黃連，約占同時期方數(shù)的86%[5]，據(jù)統(tǒng)計，宋以前13部方書中含黃連的方劑約為5%[6]。近年來，黃連降血脂、降血糖及抗癌等療效的深入研究以及新發(fā)現(xiàn)，引起了人們的廣泛關(guān)注。有研究[7]考察了小檗堿在黃連解毒湯模擬體系及全方中的腸吸收情況，發(fā)現(xiàn)在模擬體系及全方中小檗堿的吸收顯著增加，也從側(cè)面說明了復雜環(huán)境中的成分對小檗堿確有影響，也顯現(xiàn)出了復方的優(yōu)勢。Yan等[8]對口服黃連和左金丸后血中的小檗堿、巴馬汀和藥根堿的藥代動力學進行了研究，在這2種給藥方式中每個成分的藥代動力學曲線都不同，也說明了不同多成分環(huán)境對目標成分的吸收代謝等行為有著不同的影響。因此，更進一步地對黃連多成分的吸收進行研究，有重要的參考價值。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A型紫外檢測器，SIL-20A自動進樣器，日本島津公司）；BT-25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER 2100實驗室pH計（奧豪斯儀器上海有限公司）；蠕動泵驅(qū)動器（BT100-1F，保定蘭格恒流泵有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定蘭格恒流泵有限公司）；高速冷凍離心機（SIGMA，德國）。

1.2 藥物與試劑

鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212，中國食品藥品檢定研究院）；木蘭花堿對照品（批號M2903S1，上海源葉生物科技有限公司）；非洲防己堿對照品（批號Y13M6W1，上海源葉生物科技有限公司）；表小檗堿對照品（批號H25F3X1，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸藥根堿對照品（批號Z15T4B1，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸黃連堿對照品（批號ZS0924BE14，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸巴馬汀對照品（批號KS0922CF14，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸小檗堿原料（批號130808，陜西中鑫生物技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜級，美國Fisher公司）；純凈水（娃哈哈集團公司）；黃連藥材購于北京同仁堂，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學王晶娟副教授鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，體重200～250 g，北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2014-0004。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的配制

2.1.1.1 鹽酸小檗堿對照品溶液的配制 精密稱定鹽酸小檗堿對照品適量置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得鹽酸小檗堿儲備液，精密移取1 mL鹽酸小檗堿儲備液置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻后得鹽酸小檗堿對照品溶液。

2.1.1.2 混合對照品溶液的配制 分別精密稱定木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得各對照品儲備液。精密移取木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品溶液適量置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻備用，得混合對照品母液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取黃連粉末（過60目篩）0.2 g，精密稱定，加50 mL甲醇-鹽酸（100∶1），稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，精密移取續(xù)濾液2 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 Krebs-Ringer′s營養(yǎng)液（K-R液）

稱取NaCl 7.80 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.40 g；加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH到7.39～7.41，放置備用。

2.1.4 黃連水煎液的制備

取適量黃連藥材加10倍量水，常溫浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁熱濾過；藥渣加8倍量的水煎煮保持微沸30 min，趁熱濾過，合并2次濾液，濃縮，冷至常溫，加水定容得生藥質(zhì)量濃度為60 g·L-1的黃連水煎液。

2.1.5 灌流液制備

取黃連水煎液用K-R液稀釋至生藥濃度為3 g·L-1的灌流液。

2.2 含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件與適用性試驗

2.2.1.1 最大吸收波長的確定 分別取2.1項下供試品溶液與鹽酸小檗堿對照品溶液，適當稀釋后，在200～600 nm進行紫外掃描。

2.2.1.2 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 um）；檢測波長265 nm；流速0.6 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相乙腈（A）-水（B，含0.3%磷酸，0.5%三乙胺，調(diào)pH 3.0），梯度洗脫（0～2 min，13%A；2～4 min，13%～20%A；4～50 min，20%～25%A；50～55 min，25%～30%A；55～63 min，30%～70%A；63～65 min，70%～95%A；65～70 min，95%～13%A；70～80 min，68%～13%A）。

2.2.2 供試品溶液制備方法的確定

分別對提取方法、提取溶劑、提取溶劑用量、提取時間進行考察。通過超聲提取、加熱回流提取及加熱回流后超聲提取，篩選制備黃連供試品溶液的方法；通過水、水-鹽酸（100∶1）、甲醇、甲醇-鹽酸（100∶1）、乙醇、乙醇-鹽酸（100∶1）條件篩選提取溶劑制備黃連供試品溶液；通過25，50，75 mL篩選溶劑用量制備黃連供試品溶液；通過30，60，90 min篩選提取時間制備黃連供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 標準曲線制備 精密移取2.1.1項下混合對照品母液0.15，0.25，0.50，0.75，1.0，2.0 mL分別置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，配制成一系列濃度的混合對照品溶液。過0.22 μm微孔濾膜，精密吸取上述溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。分別以木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿各對照品溶液的濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線并進行回歸。

2.2.3.2 精密度試驗 取混合對照品溶液，按上述色譜條件分別重復進樣6次，測定峰面積。

2.2.3.3 重復性試驗 取同一批黃連粉末（過60目篩）6份，按2.1.2項下方法操作，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積。

2.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取新配制的供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h按上述色譜條件測定峰面積。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取黃連粉末0.1 g，分別加入精密稱定的7種生物堿對照品，按2.1.2項下方法操作，平行操作6份，按上述色譜條件測定峰面積并計算加樣回收率。

2.3 離體法及在體法對黃連水煎液中腸吸收多成分研究

2.3.1 大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸囊研究

大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，迅速取出約（10±2） cm 長各腸段（十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸），將大鼠腸管與腸系膜剝離，生理鹽水沖洗干凈后將腸段翻轉(zhuǎn)，使黏膜層在外，漿膜層在內(nèi)，用手術(shù)線結(jié)扎腸段一端形成囊狀。向小囊中加入2 mL空白Krebs-Ringer′s營養(yǎng)液，將腸囊置于含藥營養(yǎng)液的錐形瓶中，并置于水浴鍋中37 ℃保溫。期間向錐形瓶中持續(xù)通入氧及二氧化碳的混合氣體以保持離體腸囊的活性。60 min后取出腸囊內(nèi)液體，0.45 μm微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀進行檢測。

2.3.2 腸道灌流并行采血研究

大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，右側(cè)頸靜脈插管連接到蠕動泵進行供血。打開腹部，選取腸段，用37 ℃的生理鹽水沖洗干凈，結(jié)扎實驗用腸段以外的血管。對所取灌流腸段對應(yīng)的腸系膜靜脈插管，并連接到蠕動泵，收集腸系膜靜脈流出血液。腸段進口端與注射泵相連，將注射泵流速調(diào)為0.2 mL·min-1，灌流藥液，約30 min后吸收達到穩(wěn)定狀態(tài)。開始計時收集流出的藥液和血液。每隔15 min更換腸液和血液的收集管，采用質(zhì)量法進行水分校正。試驗結(jié)束后，用生理鹽水沖洗腸段，將所用腸段剪下，測量其長度和內(nèi)徑，并處死大鼠。所取血液樣品3 500 r·min-1離心15 min，取上層血漿，加入3倍量的甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，1萬r·min-1離心15 min，取上清液氮吹至干后200 μL甲醇復溶，1萬 r·min-1離心10 min，取上清液注入高效液相色譜儀進行檢測；灌流液樣品經(jīng)適當稀釋后過0.45 μm的微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀進行檢測。

2.4 數(shù)據(jù)分析[9]

翻轉(zhuǎn)腸囊法腸滲透性的表觀吸收系數(shù)Papp計算如下。

Papp=ΔQ/Δt2πrL·C0

C0為小檗堿初始濃度（mg·L-1）；ΔQ/Δt為60 min內(nèi)腸囊內(nèi)溶液中小檗堿的量（μg·s-1）；L為腸段長度（cm）；r為腸半徑（cm）。

3 結(jié)果

3.1 黃連多成分HPLC圖的建立

3.1.1 黃連多成分HPLC圖

結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿對照品溶液在429，349，265，230 nm處有吸收，黃連供試品溶液在435，348，265，228 nm處有吸收，由于在348 nm處樣品吸收干擾較小，應(yīng)選擇348 nm作為檢測波長。但是，在液相圖譜中，265 nm波長下色譜峰較多，尤其是木蘭花堿色譜峰在348 nm波長下無吸收，而在265 nm波長下能檢測到。因此，本實驗選擇265 nm為檢測波長來同時測定多個生物堿的含量。

在2.2.1.2色譜條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性良好，見圖1。

3.1.2 黃連供試品溶液

最終確定用50 mL甲醇-鹽酸（100∶1）加熱回流提取30 min時提取效果最好，且有良好的重復性。

3.1.3 方法學分析

結(jié)果表明，本方法線性良好，儀器精密度及方法重復性良好，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，加樣回收率99.53%～104.0%，RSD均小于3.0%。

3.2 黃連水煎液離體法的腸吸收測定

黃連水煎液離體翻轉(zhuǎn)腸囊實驗中空白K-R試液、經(jīng)適當稀釋后的黃連水煎液以及腸囊中樣品測定圖譜見圖2，空白K-R液對各腸段測定無干擾。腸滲透系數(shù)Papp計算結(jié)果見表1。

由以上結(jié)果可知，黃連水煎液中有7個生物堿類成分均能透過腸壁吸收，但在各腸段吸收程度各不相同，總體而言，各生物堿以十二指腸吸收為最好，其次是回腸、結(jié)腸，空腸吸收最差。

3.3 黃連水煎液在體法的腸吸收測定

黃連水煎液大鼠在體實驗中血液樣品定性測定結(jié)果見圖3，空白血漿對樣品測定無干擾。

由以上結(jié)果可知，在翻轉(zhuǎn)腸囊實驗中吸收入腸的成分在血液樣品中同樣能夠檢測到，但與灌流原液相比，入血含量微量。

4 討論

離體翻轉(zhuǎn)腸囊法可用于初步研究藥物的腸吸收情況，尤其是藥物在不同腸段的吸收差異，也可用于生物膜轉(zhuǎn)運機制的研究。該法是從體積相對較小的漿膜內(nèi)取液進行測定以考察藥物透過腸壁吸收的量，對于溶解性較差的藥物的檢測尤其適用。由于離體腸組織活性的限制，除了在操作過程中持續(xù)供氧以外，取樣時間也不宜過長[10-11]。本研究中采用離體法考察了黃連水煎液在不同腸段內(nèi)的吸收情況，結(jié)果檢測到7個生物堿成分能入腸吸收，分別為木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿。通過計算發(fā)現(xiàn)此類成分的表觀滲透系數(shù)Papp數(shù)量級在10-5～10-6級別，滲透性較差，其中木蘭花堿在各個腸段內(nèi)的吸收均比其他成分好，而其他成分的吸收情況相差不大，推測可能是由于結(jié)構(gòu)不同所致，其中木蘭花堿為阿樸菲型生物堿，而其他成分為原小檗堿型生物堿，也可能是在多成分環(huán)境中相互影響而致，具體需要通過單成分及成分配比等進一步研究。

離體實驗中成分需要透過肌肉層和基底膜層才能進入腸囊，且腸囊內(nèi)液體停滯不動，與生理條件不同，適于初步定性研究。鑒于此，為了更真實的反映藥物的吸收情況，還需要通過在體法進一步考察透過腸壁吸收的成分能否吸收進入血液循環(huán)。大鼠腸灌流并行采血法保證了實驗動物的組織器官完整，更為接近體內(nèi)狀態(tài)，以藥物實際入血量為其吸收的量，更能真實反映藥物真正吸收進入肝門靜脈的情況[12-13]。本文中采用該法進行腸吸收入血的定性研究，結(jié)果顯示上述7個成分均能入血吸收，但檢測到的成分含量均較少，具體入血含量的多少需要進一步定量分析。

目前對中藥單一成分的吸收、分布、代謝、排泄研究較多，中藥作為多成分與多靶點的藥物，是一個復雜的系統(tǒng)，其中單一成分的性質(zhì)與其在多成分環(huán)境中所表現(xiàn)出來的性質(zhì)會有差別。CMMBCS的研究分為定性研究和定量研究2個層次，中藥多成分研究所面臨的問題是在研究工作前期，中藥中的“多成分組成未知”，所以在 CMMBCS 研究中應(yīng)以吸收與否為界，分別定性研究吸收成分與非吸收成分。本文采用離體法及在體法對黃連水煎液中腸吸收多成分做初步研究，通過單一成分與提取物環(huán)境中各成分的吸收參數(shù)的比較，可解釋多成分環(huán)境對藥物吸收的影響并描述中藥的吸收特征，進一步說明中藥的科學性及合理性，為CMMBCS開展多成分的研究提供參考及示范，有利于對之后整個中藥或者復方的吸收及代謝研究提供數(shù)據(jù)支持，同時也為中藥進行質(zhì)量評價及質(zhì)量控制提供了新的研究思路，對實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

[參考文獻]

[1] 劉洋，隗麗，董玲，等.多成分體系下中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)的構(gòu)建分析[J]. 中國中藥雜志，2014， 39（23）： 4479.

[2] 侯成波，汪國鵬，張強，等. 中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)中多成分環(huán)境對葛根素溶解度的影響[J]. 中國中藥雜志，2014， 39（23）： 4499.

[3] 隗麗，汪國鵬，董玲，等. 中藥生物藥劑學分類系統(tǒng)的多成分溶出評價方法在葛根芩連片中的應(yīng)用[J]. 中國中藥雜志，2014， 39（23）： 4494.

[4] 隗麗，朱美玲，董月柳，等. 鹽酸小檗堿在黃連水煎液中的生物藥劑學分類系統(tǒng)屬性研究[J]. 中國中藥雜志，2016， 41（7）： 1192.

[5] 陳西平.影響黃連在復方中功效發(fā)揮方向的多因素研究[D]. 成都：成都中醫(yī)藥大學，2011.

[6] 陳馥馨，高曉山.含黃連方劑及黃連配伍藥的文獻統(tǒng)計[J]. 中成藥， 1997（8）： 40.

[7] 張燕， 朱華旭， 郭立瑋. 在體單向腸灌流模型研究小檗堿及其在復方配伍環(huán)境中的大鼠腸吸收特性[J]. 藥學學報，2012， 47（2）： 233.

[8] Yan R， Wang Y， Liu Y P， et al. Comparative pharmacokinetics of berberine， palmatine and jatrorrhizine in rat plasma after oral administration of Rhizoma Coptidis and Zuojinwan using liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Iran J Pharm Res， 2012， 11（3）： 949.

[9] Li H， Dong L， Liu Y， et al. Comparison of two approaches of intestinal absorption by puerarin [J]. J Pharm Toxicol Methods， 2014， 70（1）：6.

[10] Barthe L， Bessouet M， Woodley J F， et al. The improved everted gut sac： a simple method to study intestinal P-glycoprotein [J]. Int J Pharm， 1998， 173： 255.

[11] Alam M A， Al-Jenoobi F I， Al-Mohizea A M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research： limitations and application [J]. J Pharm Pharmacol， 2012， 64（3）： 326.

[12] Cummins C L， Salphati L， Reid M J， et al. In vivo modulation of intestinal CYP3A metabolism by P-glycoprotein： studies using the rat single-pass intestinal perfusion model [J]. J Pharmacol Exp Ther， 2003， 305（1）： 306.

[13] Zhang L， Lin G， Chang Q， et al. Role of intestinal first-pass metabolism of baicalein in its absorption process [J]. Pharm Res， 2005， 22（7）： 1050.

[責任編輯 孔晶晶]