鄧敏芝　鄧可眾　陳虹　吳華強(qiáng)　熊英

[摘要]目的：比較不同采收期枳實(shí)促胃腸動(dòng)力作用及辛弗林含量的差異。方法：使用不同采收期枳實(shí)的提取物對(duì)正常小鼠連續(xù)灌胃7d，測(cè)定在體小腸碳末推進(jìn)率和胃殘留率；利用HPLC測(cè)定辛弗林的含量。結(jié)果：不同采收期枳實(shí)中辛弗林含量以及對(duì)正常小鼠的小腸推進(jìn)作用均存在一定差異，但辛弗林含量的高低與小腸推進(jìn)作用并不呈線性相關(guān)。結(jié)論：枳實(shí)促胃腸動(dòng)力可能是其中多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，枳實(shí)藥材宜增加相關(guān)活性成分分析建立多指標(biāo)質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞]枳實(shí)；辛弗林；胃腸動(dòng)力；不同采收期

枳實(shí)來(lái)源于蕓香科植物酸橙及其栽培變種或甜橙的干燥幼果，江西是枳實(shí)的道地產(chǎn)區(qū)之一，而江西新干縣、樟樹(shù)等道地產(chǎn)區(qū)資源調(diào)查表明，江枳實(shí)的基源植物主要為酸橙。目前，中國(guó)藥典以辛弗林含量作為枳實(shí)藥材質(zhì)量控制的定量指標(biāo)。文獻(xiàn)分析不同品種如酸橙和甜橙、不同產(chǎn)地如江西、四川、湖南及福建枳實(shí)藥材中的辛弗林含量差異較大，炮制方法和采收時(shí)間也有顯著影響，且隨著果實(shí)的逐步發(fā)育成熟，辛弗林的含量呈降低趨勢(shì)。關(guān)于辛弗林含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)研究也屢見(jiàn)報(bào)道，如2D-HPLC、固相萃取-HPLC等。枳實(shí)為常用理氣類中藥，研究表明枳實(shí)水煎液和辛弗林能促進(jìn)正常小鼠小腸推進(jìn)，枳實(shí)還可改善功能性消化不良大鼠的胃排空。

采收時(shí)間是影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一，酸橙在每年春季5月初開(kāi)花，5月中下旬至6月下旬自然脫落的幼果作為藥材枳實(shí)，至7月初果皮尚綠時(shí)的未成熟果實(shí)則當(dāng)作枳殼藥用；部分植株在秋季可二次開(kāi)花結(jié)果，其幼果也被當(dāng)作枳實(shí)銷售。不同采收期枳實(shí)藥材的大小較為懸殊，從小到大依次稱為雞眼枳實(shí)、鵝眼枳實(shí)、小片、中片及大片。這些枳實(shí)均在市場(chǎng)上銷售、使用，然在在藥效方面是否存在顯著性差異尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，秋季枳實(shí)中的成分和藥效等各方面亦無(wú)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)觀察不同采收期枳實(shí)對(duì)在體小鼠小腸碳末推進(jìn)率和胃殘留率的差異，并結(jié)合HPLC測(cè)定相應(yīng)的辛弗林含量進(jìn)行對(duì)比分析，為制定適宜采收期及完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1.儀器與材料

1.1藥材 2014年采集于江西省樟樹(shù)市昌傅鎮(zhèn)下余村，1～4號(hào)分別為5月下旬、6月中旬、6月下旬及10月中旬采收，經(jīng)鑒定為蕓香科植物酸橙C.aurantium L的幼果。

1.2動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠50只，體重20-25 g，雄性，由江西中醫(yī)藥大學(xué)陽(yáng)明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（贛）2011-0001。

1.3儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（G1311C四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4212B DAD檢測(cè)器、Agilent 1260LC化學(xué)工作站，美國(guó)Agilent Technologies公司），METFLER TOLEDOXS3DU百萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）。

2.小腸推進(jìn)及胃排空作用的實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1藥物的制備 分別稱取枳實(shí)藥材適量，粉碎為中粉，加入適量蒸餾水，水煎煮提取2次，每次30min，合并濾液并濃縮，制成每lmL相當(dāng)于1g原藥材的提取液。

2.2給藥及指標(biāo)測(cè)定 50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即4個(gè)枳實(shí)樣品組和空白對(duì)照組。樣品組小鼠按4g/Kg分別給予不同產(chǎn)地枳實(shí)提取物，空白組給予等體積生理鹽水。連續(xù)灌胃給藥7d，每日1次。末次給藥后，動(dòng)物禁食12h，小鼠灌胃給予炭末混懸液0.5mL（2%CMC-Na和5%炭末），20min后處死動(dòng)物，剖腹取出上端自幽門、下端至回盲部的腸管，鋪直后測(cè)量幽門至回盲部全長(zhǎng)（小腸總長(zhǎng)度）及幽門至炭末前沿的距離（炭末推進(jìn)長(zhǎng)度），計(jì)算小腸推進(jìn)百分率；結(jié)扎上述小鼠的胃賁門和幽門，取濾紙拭干后稱全重，然后沿胃大彎剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物后用濾紙拭干，稱取胃凈重，胃全重和胃凈重差值為胃內(nèi)殘留物重，并計(jì)算與所灌炭末混懸液質(zhì)量的百分比為胃殘留率。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4結(jié)果 由表1可知，樣品組碳末小腸推進(jìn)率均大于空白組，其中1、3號(hào)枳實(shí)組的小腸推進(jìn)率與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。不同采收期枳實(shí)的碳末小腸推進(jìn)率同樣存在一定差異性，1號(hào)和2號(hào)、4號(hào)之間存在存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。所有樣品組的胃殘留率和空白組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3.HPLC測(cè)定辛弗林的方法與結(jié)果

3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：TSK-GELODS（250mm×4.6mm，5lxm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25：75，水中加0.1%磷酸和0.1%SDS）；流速：1.0mL/min，柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20uL；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；理論塔板數(shù)>15000。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

3.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取辛弗林適量，加甲醇溶解于容量瓶中配制成693.00ug/mL濃度的對(duì)照品溶液。

3.3樣品溶液的制備 取藥材中粉適量，精密稱定，按2015版中國(guó)藥典一部枳實(shí)項(xiàng)下含量測(cè)定相同方法進(jìn)行制備。

3.4線性關(guān)系的考察 將配置好的母液稀釋成693.00、346.50、173.25、86.63、43.31、21.66、10.83、5.41、2.71ug/mL等一系列濃度梯度的對(duì)照品溶液。按照“3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣20ul測(cè)定，計(jì)算峰面積Y與濃度x的線性方程、檢測(cè)限及定量限，得回歸方程：Y=4.2843X+5.2456（r=0.9998），在2.71～693.00ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為1.31ug/mL，定量限為4.36ug/mL。

3.5精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算辛弗林峰面積的RSD為0.49%，表明精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（2014年5月下旬采集于江西新干縣，批號(hào)：S9），分別于0、2、4、6、8、24 h時(shí)進(jìn)樣，結(jié)果，辛弗林峰面積的RSD為1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一份樣品適量6份（批號(hào)：S9），按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，辛弗林含量的RSD為1.95%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.8回收率試驗(yàn) 稱取枳實(shí)粉末（批號(hào)：S9）0.5g 6份，精密加入一定量的辛弗林對(duì)照品溶液，按“3.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，同上分析條件測(cè)定含量并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.9樣品含量測(cè)定 取不同采收期枳實(shí)藥材的水提物，按“3.2.2”項(xiàng)下方法平行制備2份供試品溶液，同以上色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由含量測(cè)定結(jié)果可知，不同采收期包括秋季采集江枳實(shí)中辛弗林含量均符合2015版藥典標(biāo)準(zhǔn)（>0.3%），其中以5月底收集的樣品辛弗林含量為最高，隨果實(shí)生長(zhǎng)其中所含辛弗林呈逐步下降趨勢(shì)，在采收末期6月下旬下降約為一半；藥理實(shí)驗(yàn)表明枳實(shí)的水提物對(duì)正常小鼠小腸具有明顯的推進(jìn)作用，對(duì)正常小鼠胃排空無(wú)明顯影響，不同采收期枳實(shí)對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用也存在一定的差異性，以5月下旬收集樣品的活性最強(qiáng)，6月中旬、下旬收集樣品和秋季枳實(shí)對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用雖有所減弱，但辛弗林含量最低的6月下旬采集樣品的小腸推進(jìn)作用并非為最弱，二者對(duì)比分析，枳實(shí)對(duì)正常小鼠的小腸推進(jìn)作用與其中辛弗林含量的變化趨勢(shì)并不完全呈線性相關(guān)。

4.討論

不同采收期枳實(shí)中辛弗林的含量以及對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用均有明顯差異，5月下旬收集枳實(shí)中辛弗林含量高且活性強(qiáng)，但此時(shí)果實(shí)極小，直徑僅約0.5 cm左右，6月底采收的枳實(shí)直徑最大，約2～2.5 cm，雖含量最低但活性較好，根據(jù)對(duì)正常小鼠小腸的推進(jìn)作用及藥材大小分析，枳實(shí)在5月下旬或者6月下旬采收較佳。

前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道表明枳實(shí)中化學(xué)成分除辛弗林外，還含有較多的黃酮類如新橙皮苷、柚皮苷以及香豆素類如馬爾敏、水合橙皮內(nèi)酯，其中，新橙皮苷的含量可高達(dá)20%以上，而且枳實(shí)黃酮和香豆素均有胃腸動(dòng)力作用。因此藥典標(biāo)準(zhǔn)中枳實(shí)藥材僅以辛弗林為定量指標(biāo)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)尚需進(jìn)一步完善，建議建立生物堿、黃酮以及香豆素類多指標(biāo)性成分分析的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。