李立恒 王 蕊 王 芹 王鐘華

Omi/HtrA2在腺樣囊性癌的表達及其臨床意義

李立恒 王 蕊 王 芹 王鐘華

目的 探討Omi/HtrA2在不同分型腺樣囊性癌中的表達差異，并評價其對腺樣囊性癌的臨床意義。方法 納入確診為腺樣囊性癌的患者100例，應用免疫組織化學染色方法，檢測Omi/HtrA2在不同分型腺樣囊性癌中的表達；并檢測腺樣囊性癌轉移組和非轉移組患者中Omi/HtrA2表達情況。結果 Omi/HtrA2表達主要位于細胞胞質中，在腺樣囊性癌組織中其陽性率為83%；腺樣囊性癌低級組與高級組間表達情況具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但不同分型的腺樣囊性癌組織中其表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Omi/HtrA2在轉移組腺樣囊性癌中陽性率為93.1%，在非轉移組中其陽性率為46.2%，兩組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結論 Omi/HtrA2與腺樣囊性癌的發(fā)病密切相關，可作為臨床判斷腺樣囊性癌的輔助性指標，對臨床的診治及預后的判斷具有一定的指導價值。

Omi/HtrA2；腺樣囊性癌；分型；腫瘤轉移

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:738～741)

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC) 是頜面部腫瘤中發(fā)病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，極易發(fā)生局部浸潤和神經(jīng)侵襲轉移，且其浸潤性極強，易侵入血管，造成血運轉移，預后不佳，但本病帶瘤生存時間相對較長，對患者的生存質量產生重大的影響[1-2]。隨著現(xiàn)代分子生物學和遺傳學的發(fā)展，該病與相關基因的激活及抑癌基因的失活具有密切的相關性，近年來Omi/HtrA2基因不斷被人們所認識，該基因是1種高度保守的轉錄調節(jié)因子，其表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，特別是對于腫瘤的轉移有著重要的影響，但是目前對于該基因在腺樣囊性癌的影響報道尚少[3-4]。本研究采用免疫組織化學染色的方法檢測Omi/HtrA2基因在人類腺樣囊性癌中的不同分型中的表達差異，結合腫瘤分型對表達差異情況進行研究，并搜集所納入研究的患者術后發(fā)生轉移及非轉移情況，評價其對腺樣囊性癌臨床價值，為進一步闡明該基因在腺樣囊性癌的疾病發(fā)病及治療中的作用，為今后基因靶向治療研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006年1月至2013年1月在我院確診的腺樣囊性癌100例患者的臨床資料，年齡14～75歲，平均年齡(26.25±10.23)歲，女性31例，男性69例，所有納入研究的腺樣囊性癌患者均手術后取活檢，均經(jīng)病理確診，其中28例隨訪了10年，60例隨訪了5年。均為單側腺體發(fā)病，其中左側發(fā)病51例，右側發(fā)病9例，發(fā)病部位：舌下腺13例，腮腺64例，23例頜下腺。臨床分期及病理類型參照國際WHO的診斷標準[4]進行分析判斷，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期30例，Ⅲ期28例，Ⅳ期23例；篩孔狀24例、管狀型26例、實體型36例，混合型14例。按照病理組織學分型，根據(jù)惡性程度進行分級，分為3級，其中1級26例，2級40例，3級34例。

1.2 診斷標準

參照《臨床診療指南腫瘤學分冊》[5]對腺樣囊性癌的診斷標準制定。

1.3 納入標準與排除標準

納入標準：①年齡14～75歲；②符合本病診斷標準；③愿意接受本臨床研究，依從性強。

排除標準：①妊娠期、哺乳期患者；②惡性腫瘤、有嚴重其他系統(tǒng)疾病患者；③依從性差，不愿意接受本臨床研究。

1.4 研究方法

1.4.1 主要試劑、細胞與儀器 試劑：兔單克隆IgG Omi/HtrA2抗體和多克隆IgG β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)。HRP標記山羊抗小鼠IgG，免疫組化試劑盒(武漢博士德)，HRP標記山羊抗兔IgG(上海碧云天生物)。

儀器：高轉速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)，-80 ℃～4 ℃冰箱(日本松下)，倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.4.2 免疫組化方法 應用SP檢測法，取二甲苯脫蠟后的腺樣囊性癌組織切片，無水乙醇分級水化，以 PBS 0.01 mol/L洗3次，多聚甲醛40 g/L固定15 min，雙氧水消除內源性過氧化物酶體積分數(shù)3% 結合15 min，50 μl非免疫動物血清封閉，Omi/HtrA2一抗50 μl 過夜，第二抗體50 μl生物素標記，辣根過氧化物酶孵育，再行DBA顯色，蘇木精復染，最后中性樹膠固封。結果判定：陽性細胞為在倒置顯微鏡下細胞胞質胞膜出現(xiàn)深棕黃色的著色，平均光密度采用Image J軟件進行測量。

1.5 實驗結果的判定

陽性結果判定：Omi/HtrA2染色顆粒位于胞質之中。通過顯微鏡10×40倍視野，每張切片對應隨機納入10個視野進行陽性細胞計數(shù)，陽性細胞數(shù)>50%為強陽性(+++)，25%～50%陽性(++)，0～25%為弱陽性(+)，未著色為陰性(-)。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Omi/HtrA2在腺樣囊性癌中的表達

觀察Omi/HtrA2在腺樣囊性癌中的表達，結果顯示，免疫組化陽性染色分布于細胞質內，也有分布于細胞核內，呈棕色或者褐色，100例腺樣囊性癌患者的病變組織切片中有83例陽性染色，其中弱陽性20例，中度陽性28例，強陽性35例，與正常人體組織Omi/HtrA2表達相比較，具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 Omi/HtrA2在腺樣囊性癌中的表達情況/例

2.2 Omi/HtrA2表達與腺樣囊性癌腫瘤分型的相關性

Omi/HtrA2在不同病理分型腺樣囊性癌中的表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 Omi/HtrA2與腺樣囊性癌惡性分級的相關性

根據(jù)惡性程度分為3級，其中1級26例中14例陽性，2級40例中36例為陽性，3級34例中31例為陽性，經(jīng)統(tǒng)計，3級其陽性率高于2級和1級，2級陽性率又高于1級，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4 Omi/HtrA2 在腺樣囊性癌轉移組與非轉移組中表達情況比較

結果顯示，在轉移腺樣囊性癌患者中Omi/HtrA2陽性率為93.1%，在非轉移組中其陽性率為46.2%，兩組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表4。

表2 Omi/HtrA2表達與腺樣囊性癌病理分型的 相關性(例，%)

表3 Omi/HtrA2與腺樣囊性癌惡性分級的相關性(例，%)

注：與1級相比，①為P<0.05；與2級比較，②為P<0.05。

表4 Omi/HtrA2在腺樣囊性癌轉移組與非轉移組 中的表達情況(例，%)

3 討論

腺樣囊性癌是頜面部腫瘤中發(fā)病率較高的腫瘤，也是涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有涎腺腫瘤的14.5%，約占全部涎腺惡性腫瘤的40%，5年生存率約為20%。極易發(fā)生局部浸潤和神經(jīng)侵襲轉移[6-7]。近年來涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，雖然治療水平不斷提高，但是患者的生存率并未得到明顯提高，其轉移與復發(fā)仍是其死亡的主要原因[8]。國內外目前對涎腺腺樣囊性癌的診斷研究主要集中在病因學、遺傳基因、早期診斷手段的研究，治療方面研究主要集中在放射、化學以及手術方法改進等方面，雖然取得了一定進展，但該病的發(fā)病率及死亡率并未得到明顯降低，說明研究的深度尚不足，研究還處于基礎階段尚未應用于臨床[9]。由于涎腺腺樣囊性癌作為惡性腫瘤，對人類生命具有重大的威脅。因此，進一步尋找有關涎腺腺樣囊性癌復發(fā)、轉移生物標記物及敏感特異是該病有效治療、提高生存率的關鍵點。其次做好涎腺腺樣囊性癌發(fā)病的預防及早期發(fā)現(xiàn)，減少其發(fā)病率和轉移率，是今后研究的重要方向[10]。

由于疾病發(fā)病隱匿，進展很快，很多患者就診時已到達晚期，同時目前還缺乏腺樣囊性癌的診斷和治療靶標，因此尋找生物學靶標對于疾病的診治至關重要，本研究為探求該病的侵襲機制，尋找靶點基因與疾病的相關性，對該病的治療和預后判斷提供一定的指導價值[11]。目前，僅少量報道關于腺樣囊性癌中Omi/HtrA2 的表達情況，但缺乏對Omi/HtrA2 與腺樣囊性癌關系的更深入研究和病例報道，本研究對腺樣囊性癌的深入研究具有重要的研究意義。

目前研究顯示，Omi/HtrA2最早是因與凋亡抑制蛋白(IAPs)有結合能力，與細菌內蛋白酶HtrA2 (h igh2temper2atu re requ iremen t) 同源，是1種線粒體絲氨酸蛋白酶,定位于線粒體，可拮抗IAPs而被分離確定[12]。最新的幾年研究發(fā)現(xiàn)Omi/HtrA2可作為1種癌基因，不僅是是上皮-間質轉變過程中的關鍵因子，且Omi/HtrA2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，影響腫瘤細胞的凋亡，其高表達可能促進癌細胞的惡化，可以視為1種癌基因和凋亡抑制蛋白，表達水平與腫瘤各亞型的惡性程度也密切相關，可抑制凋亡呈現(xiàn)出抗凋亡的激活，增強細胞的抗凋亡能力。有研究表明該基因可以通過多條通路抑制癌基因的正常表達和轉錄，發(fā)揮抑制癌細胞凋亡的作用，促進腫瘤的發(fā)展[13]。近年來國內外研究表明，Omi/HtrA2的作用為：①促進細胞凋亡的發(fā)生；②具有修復、降解線粒體中折疊錯誤的蛋白質的作用,并可以通過破壞caspase與X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X IAP)之間的相互作用和直接利用其自身具有的蛋白酶活性引起細胞凋亡。已有研究證實Omi/HtrA2當它呈異常表達可以導致腫瘤的發(fā)生，在調節(jié)細胞凋亡中發(fā)生重要作用。另有實驗也證明Omi/HtrA2 呈異常表達可以導致腫瘤的發(fā)生，Omi/HtrA2在調節(jié)細胞凋亡中發(fā)生重要作用。在72% 的胃腺癌中Omi/HtrA2 呈現(xiàn)高表達，而在正常胃黏膜中表達較弱[14]。

到目前為止，研究人員已在前列腺癌、乳腺癌、喉癌等腫瘤組織中檢測到Omi/HtrA2高表達特征，研究還證實了該基因及腫瘤細胞的轉移和侵襲有關，通過降低黏附蛋白的表達，抑制細胞轉錄水平，從而有助于腫瘤的侵襲，進而促進腫瘤血管生成[15]。這些研究結果提示：Omi/HtrA2與某些惡性腫瘤的分化程度有重要關系，在這些惡性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起了非常重要的作用，但是在腺樣囊性癌中的研究尚少。因此，Omi/HtrA2不僅與腫瘤形成有關，還與腫瘤的轉移相關。因此本研究通過深入探討該指標在腺樣囊性癌中表達的情況以了解其臨床意義，結果顯示，Omi/HtrA2表達主要位于細胞的胞漿中，在腺樣囊性癌患者的組織中陽性率為83%，這說明該基因在腺樣囊性癌中具有高表達的表現(xiàn)，其可能的機制是通過抑制腫瘤細胞的凋亡有關；腺樣囊性癌低級與高級組的表達情況之間具有統(tǒng)計學差異，說明該基因在病理分型表達沒有差別，但不同分型的腺樣囊性癌病理組織的表達差異無統(tǒng)計學意義；Omi/HtrA2在轉移組的腺樣囊性癌患者中陽性率為93.1%，在非轉移組中的陽性率為46.2%，兩組比較具有統(tǒng)計學差異，這也提示了該基因可能參與了腺樣囊性癌的轉移和侵襲過程。

綜上所述，我們推測，Omi/HtrA2可能通過其抑制細胞凋亡和促侵襲的作用對腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮調控作用。本研究闡明了腺樣囊性癌的分子相關性，但是其主要的發(fā)病機制有待于深入的研究，同時通過本研究也為腺樣囊性癌的臨床診斷和預后判斷提供了新的策略方法，確定了Omi/HtrA2與腺樣囊性癌的相關性，研究了不同腫瘤分型對其表達的差異，探討了該基因對腺樣囊性癌的生物學相關性，也為今后進一步對腺樣囊性癌的診治提供理論依據(jù)。

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(編輯：吳小紅)

Omi/HtrA2 Epression and Clinical Significance of Adenoid Cystic Carcinoma

LILiheng,WANGLei,WANGQin,etal.

TheFirstClinicalMedicalSchool,Zhangjiakou,075000

Objective To investigate the expression of Omi/HtrA2 in different subtypes of adenoid cystic carcinoma and to evaluate its clinical significance for adenoid cystic carcinoma.Methods 100 cases of patients diagnosed with adenoid cystic carcinoma were enrolled.The expression of Omi/HtrA2 in different subtypes of adenoid cystic carcinoma was detected by immunohistochemical staining.The expression of Omi/HtrA2 in adenoid cystic carcinoma and non-metastatic group were detected.ResultsThe expression of Omi/HtrA2 was mainly located in cytoplasm and 83% in adenoid cystic carcinoma.The expression of Omi/HtrA2 was statistically different (P<0.05) (P>0.05).The positive rate of Omi/HtrA2 in the adenoid cystic carcinoma was 93.1% in the non-metastatic group,but the difference was not statistically significant (P>0.05).The positive rate was 46.2%,the 2 groups were statistically significant (P<0.05).Conclusion Omi/HtrA2 incidence of adenoid cystic carcinoma is closely related to clinical judgment as adenoid cystic carcinoma auxiliary index,has a guiding value for diagnosis and clinical prognosis.

Omi/HtrA2;Adenoid cystic carcinoma;Typing;Tumor metastasis

075000 河北北方學院第一臨床醫(yī)學院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.013

R739.81

A

1001-5930(2017)05-0738-04

2016-07-08

2017-03-12)