鐘永娜

摘 要：在Pb2+脅迫下，添加外源水楊酸（SA）培養(yǎng)的玉米幼苗葉片中過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性提高，過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性降低，丙二醛（MDA）的積累減少，顯示SA對(duì)Pb2+脅迫下玉米幼苗的保護(hù)酶具有不同的影響。

關(guān)鍵詞：水楊酸；玉米；保護(hù)酶；Pb2+

隨著工業(yè)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，重金屬污染越來(lái)越嚴(yán)重。鉛是重金屬污染中的主要元素之一，它可隨著汽車排放的廢氣及城市污水而污染空氣和土壤。鉛不是植物生長(zhǎng)的必需元素，而是一種對(duì)植物有積累性危害的污染物質(zhì)，當(dāng)鉛在植物體內(nèi)積累過(guò)多時(shí)，并會(huì)對(duì)植物造成毒害作用，如：鉛可抑制種子內(nèi)蛋白酶、淀粉酶等活性受到抑制，直接影響種子內(nèi)儲(chǔ)藏淀粉和蛋白質(zhì)的分解，從而影響種子萌發(fā)所需的物質(zhì)和能量，致使種子萌發(fā)受到抑制；鉛脅迫可導(dǎo)致植物體內(nèi)酶的失活、變性，甚至酶的破壞；鉛也可以破壞葉綠素酸醋還原酶的活性從而導(dǎo)致植物的葉綠素含量減少，影響光合作用。鉛可通過(guò)食物鏈在人體和動(dòng)物組織中蓄積，當(dāng)鉛在體內(nèi)累積過(guò)多時(shí)會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用，如：鉛進(jìn)入人體后，會(huì)阻礙血液的合成，導(dǎo)致人體貧血，出現(xiàn)頭痛、眩暈、乏力、困倦、便秘和肢體酸痛等癥狀。

水楊酸（Salicylicacid，簡(jiǎn)稱SA），即鄰羥基苯甲酸，是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡(jiǎn)單酚類化合物，Raskin提出可以把它看成是一種新的植物內(nèi)源激素，廣泛存在于高等植物中。水楊酸在植物的抗病、抗低溫、抗旱和抗鹽等方面，以及對(duì)果實(shí)成熟、園藝產(chǎn)品保鮮和種子萌發(fā)等方面具有明顯的作用，能緩解逆境對(duì)植物造成的傷害，增強(qiáng)植物的抗逆性能力，如：植物在鹽脅迫條件下水楊酸含量能夠顯著提高鈉離子向下和鉀離子向上運(yùn)輸選擇性，因此能夠提高植物體的抗鹽性；水楊酸也可促進(jìn)植物葉片中木質(zhì)素含量的增加，導(dǎo)致細(xì)胞壁木質(zhì)化為植物抵抗病原生物的進(jìn)一步侵染提供了有效的保護(hù)屏障等。那水楊酸對(duì)玉米幼苗在抗鉛毒害中的效應(yīng)如何呢？本文研究SA對(duì)玉米幼苗Pb2+脅迫下的保護(hù)酶活性的影響，測(cè)定玉米幼苗在鉛脅迫下有無(wú)水楊酸時(shí)玉米幼苗葉片的保護(hù)酶——過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性及MDA含量的變化，以此判斷水楊酸對(duì)玉米幼苗鉛脅迫下保護(hù)酶活性的影響效應(yīng)。

1材料與方法

1.1材料與處理

植物材料為玉米晴三。挑選均勻飽滿的種子，經(jīng)0.1%HgCl2消毒10min后，漂洗干凈，用蒸餾水在25℃下浸泡12小時(shí)后播種到墊有4層經(jīng)蒸餾水濕潤(rùn)濾紙的帶蓋磁盤[24cm×16cm]中，于28℃/25℃（晝/夜）下暗萌發(fā)60h。萌發(fā)期間的12h、24h、36h、和48h用蒸餾水20mL進(jìn)行澆灌。60小時(shí)后開(kāi)蓋培養(yǎng)，用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液100mL間隔12h繼續(xù)澆灌，待玉米長(zhǎng)出兩葉一心時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗進(jìn)行處理。上述玉米幼苗一組用濃度為（0、200mol·L-1）的SA溶液50mL和濃度為（0、100、200、300、400mg·L-1）的醋酸鉛溶液50mL混合澆灌，另一組用濃度為（0、100、200、300、400mg·L-1）的醋酸鉛溶液100mL澆灌，每隔12h澆灌一次，待玉米長(zhǎng)出三葉一心時(shí)測(cè)定葉片的POD、APX、CAT活性和的MDA含量，以選取玉米幼苗的第二葉片為測(cè)定材料。

1.2APX、POD、CAT酶活性和丙二醛（MDA）含量測(cè)定

APX的測(cè)定：APX可催化AsA與H2O2反應(yīng)，使AsA氧化成單脫氫抗壞血酸MD-AsA，因此在酶提取液中加入AsA，可測(cè)定APX的活性[12]。準(zhǔn)確稱取玉米葉片0.5g，加入5mL提取液，低溫研磨成勻漿，離心（15000r/min，4℃，15min），取3mL上清液稀釋至5mL用于酶活性的測(cè)定。在290nm處測(cè)定OD值，記錄OD290變化，以25下℃下1min內(nèi)OD290變化0.01定義為1個(gè)酶活力單位（U），最后以U/g（FW）.min表示酶的活性。

POD、CAT的測(cè)定：H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收峰，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度隨反應(yīng)時(shí)間增加而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。

在H2O2存在條件下，POD能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)生成物來(lái)測(cè)定POD的活性。

準(zhǔn)確稱取玉米葉片0.2g，加入5mLpH為7.8，50mmol/L磷酸緩沖液，低溫研磨成勻漿，離心（15000r/min，4℃，15min），上清定容至5mL，用于酶活性的測(cè)定。

在240nm處測(cè)定CAT酶活力，記錄OD240的變化，以25下℃1min內(nèi)OD240變化0.01定義為1個(gè)酶活力單位（U），最后以U/g（FW）.min表示酶的活性。

在470nm處測(cè)定POD酶活力，記錄OD470變化，以25下℃1min內(nèi)OD470變化0.01定義為1個(gè)酶活力單位（U），最后以U/g（FW）.min表示酶的活性。

MDA的測(cè)定：硫代巴比妥酸（（TBA）法測(cè)定MDA。準(zhǔn)確稱取玉米葉片0.5g，加入5.0ml5%三氯醋酸，、研磨成勻漿，離心（4500r/min，10min），取上清夜2.0ml加入0.67%TBA2mL沸水浴30分鐘后快速冷卻，在離心（4500r/min，10min），取上清液于波長(zhǎng)450nm、532nm、600nm處測(cè)定其OD值，最后利用公式6.45*（OD532-OD600）-0.56*OD450算出結(jié)果，單位為mol/L。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SigmaPlot9.0處理。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1外源SA對(duì)玉米幼苗鉛脅迫下CAT酶活性的影響

圖1顯示：當(dāng)鉛脅迫濃度為100mg/L時(shí)顯著提高了玉米幼苗葉片的CAT活性，表現(xiàn)為激活效應(yīng)，隨著鉛脅迫濃度的升高，其CAT活性顯著降低，激活效應(yīng)轉(zhuǎn)為抑制效應(yīng)。經(jīng)單一SA處理的玉米幼苗葉片中的CAT活性也略高于對(duì)照組。加入200mol/LSA與鉛共同處理幼苗后，其CAT活性上升，表現(xiàn)為在脅迫濃度為200mg/L時(shí)的上升效果最顯著，說(shuō)明加入SA后脅迫得以緩解。

2.2外源SA對(duì)玉米幼苗鉛脅迫下POD酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明：鉛脅迫增加了玉米幼苗葉片POD的活性，加入SA可使酶活性有一定程度的降低。經(jīng)單一SA處理的玉米幼苗葉片的POD活性略低于對(duì)照組。玉米幼苗受單一鉛脅迫后，葉片中POD活性上升，其上升幅度較小。受鉛脅迫的玉米幼苗同時(shí)外加SA處理后，葉片中POD活性比未加SA的有所減小，在脅迫濃度在100mg/L到200mg/L時(shí)的下降相對(duì)明顯。

2.3外源SA對(duì)玉米幼苗鉛脅迫下MDA含量的影響

圖3表明，玉米幼苗受鉛脅迫后，葉片中MDA含量提高，在脅迫濃度為100mg/L時(shí)上升較小，后隨著鉛濃度的增加，MDA含量迅速上升。未受鉛傷害的玉米幼苗在外加SA后，葉中MDA含量略有下降，同時(shí)受鉛傷害并外加SA的幼苗MDA含量也下降，下降在鉛濃度為200mg/L時(shí)較為顯著。由此認(rèn)為，一定濃度的SA能降低植物葉中的MDA含量，減弱膜脂的過(guò)氧化作用，從而提高植物的抗鉛傷害能力。

2.4外源SA對(duì)玉米幼苗鉛脅迫下APX酶活性的影響

圖4表明：在無(wú)鉛脅迫時(shí)，SA處理略提高了玉米幼苗葉片的APX酶活性。單一鉛處理玉米幼苗時(shí)，葉片中APX酶活性隨鉛脅迫強(qiáng)度增大而上升，上升速率在脅迫濃度為100mg/L時(shí)最大，外加SA同時(shí)處理，減小了葉片中的APX酶活性。

3分析討論

植物在逆境下，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可進(jìn)一步生成氫氧自由基。使自由基的產(chǎn)生和消除之間的平衡被打破，氫氧自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，可使膜脂飽和脂肪酸雙鍵被過(guò)氧化，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，最終加速細(xì)胞的衰老和解體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，受鉛脅迫時(shí)，葉片中MDA含量提高，其幅度隨鉛濃度的增加而增大，而MDA是由于逆境條件下，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的，它在細(xì)胞內(nèi)的含量多少表示脂質(zhì)過(guò)氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)傷害的程度，是逆境生理中一個(gè)重要指標(biāo)。MDA升高，說(shuō)明生物膜系統(tǒng)脂質(zhì)過(guò)氧化程度升高，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，最終造成生物體的傷害。由此說(shuō)明，鉛脅迫對(duì)植物確有傷害作用。

CAT、POD、APX是植物體內(nèi)的保護(hù)酶。過(guò)氧化氫酶（CAT）可以清除H2O2、分解氫氧自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。POD廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化。它與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。能清除H2O2。APX是植物AsA-GSH氧化還原途徑的重要組分，是植物體內(nèi)尤其是葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶。

單一鉛脅迫濃度為100mg/L時(shí)顯著提高了玉米幼苗葉片的CAT活性，表現(xiàn)為激活效應(yīng)，隨著鉛脅迫濃度的升高，其CAT活性顯著降低，激活效應(yīng)轉(zhuǎn)為抑制效應(yīng)。這與袁金萍、李雪梅等的研究結(jié)果相同，與Guo等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。CAT活性隨鉛濃度上升而先增后降的原因可能是：CAT是植物細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的抗氧化酶，其主要功能是清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的過(guò)氧化氫，在低濃度鉛脅迫時(shí)，使植物體內(nèi)產(chǎn)生較多過(guò)氧化氫，作為一種抗體自衛(wèi)反應(yīng)，CAT上升提高清除H2O2的能力。當(dāng)Pb2+濃度超過(guò)極限，H2O2明顯增加，過(guò)多的H2O2會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)活性的羥自由基和單線氧，給細(xì)胞造成更大的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞防御活性相應(yīng)減弱，此時(shí)CAT酶活性不能相應(yīng)提高。外加200mol/LSA與鉛共同處理后，幼苗CAT活性明顯上升，說(shuō)明加入SA后脅迫得以緩解，這與李彩霞[22]等的研究結(jié)果相同，與陳珍的研究結(jié)果相反，這可能是植物種類不同及重金屬濃度不同所造成的。

植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)在正常條件下保持著盡可能低的水平，玉米幼苗在鉛脅迫下，首先啟動(dòng)了體內(nèi)抗氧化酶POD、APX來(lái)驅(qū)除由于重金屬毒害產(chǎn)生的大量自由基，而使POD活性隨重金屬濃度的升高而增加，這與前人研究相符。同時(shí)APX酶活性也隨鉛脅迫強(qiáng)度增大而呈上升趨勢(shì)，SA處理能有效緩解鉛引起的細(xì)胞傷害和氧化脅迫，因而APX、POD活性比單獨(dú)鉛處理時(shí)低。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陳珍、陳靜的研究結(jié)果相等同。

加入SA處理后，葉片的MDA含量下降了，說(shuō)明植物膜脂的過(guò)氧化作用被減弱，由此緩解了鉛的毒害作用，提高了植物的抗鉛傷害能力，與很多學(xué)者的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究結(jié)果說(shuō)明了水楊酸對(duì)玉米幼苗鉛脅迫下的保護(hù)酶有不同的影響，從整體上來(lái)看，起到緩解鉛對(duì)玉米幼苗的毒害作用，為被污染日益嚴(yán)重的農(nóng)作物提高生產(chǎn)質(zhì)量尋求一個(gè)有效的方法提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]洪春來(lái)，賈彥博，王潤(rùn)屹等.鉛毒害對(duì)蔬菜生長(zhǎng)影響的研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（20）：2-3.

[2]秦普豐，鐵柏清，周細(xì)紅等.鉛與鎘對(duì)棉花和水稻萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000（03）：1-2.

[3]張紅萍.鉛對(duì)植物的毒害及植物對(duì)鉛的抗性機(jī)制[J].農(nóng)業(yè)裝備技術(shù)，2007（03）.

[4]金王進(jìn)，袁金萍.鉛對(duì)小麥保護(hù)酶系統(tǒng)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（02）.

[5]韋友歡，黃秋嬋.鉛對(duì)人體健康的危害效應(yīng)及其防治途徑[J].微量元素與健康研究，2008（04）：2-5.

[6]RASKIN I.Salicylic acid，A new p lant hormone[J].Plant Physiol，1992（99）：799-803.

[7]齊秀東.水楊酸對(duì)植物的生理作用（綜述）[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2007（01）.