孫龍云

(張家口學(xué)院醫(yī)學(xué)系，河北 張家口 075000)

DNA甲基結(jié)合蛋白2調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞終末分化的作用及機(jī)制

孫龍云

(張家口學(xué)院醫(yī)學(xué)系，河北 張家口 075000)

目的 探究DNA甲基結(jié)合蛋白(MeCP)2調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)終末分化的作用及機(jī)制。方法 ①采用Western印跡方法觀察MeCP2沉默對OPCs分化成熟的影響；②運(yùn)用甲基特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(BSP)和定量實時PCR(qRT-PCR)探究少突終末標(biāo)志物內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Sry相關(guān)Box17因子(SOX)10、DNA甲基結(jié)合蛋白(MBP)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、髓鞘脂蛋白(PLP)甲基化和表達(dá)變化。結(jié)果 與正常細(xì)胞相比，在MeCP2沉默的OPCs中，與OPCs分化成熟相關(guān)2',3'-環(huán)核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP)重組蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，同時SOX10、MBP、MAG、PLP表達(dá)均明顯上調(diào)；但呈現(xiàn)低甲基化水平。結(jié)論 MeCP2沉默可促進(jìn)OPCs終末分化標(biāo)志物的表達(dá)及甲基化水平的降低，從而促進(jìn)OPCs成熟分化。

DNA甲基結(jié)合蛋白(MeCP)2；少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；終末分化

髓鞘異常是導(dǎo)致老年腦組織退行性病變的主要元素，不可避免的脫髓鞘直接導(dǎo)致腦神經(jīng)功能退化，最終引起老年癡呆。少突膠質(zhì)細(xì)胞的主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)、維持和保護(hù)神經(jīng)元的正常功能。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)分化成熟異常是導(dǎo)致髓鞘異常的直接原因，OPCs分化成熟是中樞神經(jīng)髓鞘形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),但其調(diào)控機(jī)制不清。OPCs分化成熟受遺傳和環(huán)境因素共同調(diào)控，DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)的一種表觀遺傳修飾，其不涉及DNA序列的改變，但可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究顯示DNA甲基化在OPCs分化成熟和髄鞘再生障礙中發(fā)揮了重要作用〔1〕。DNA甲基化的主要途徑是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，通過DNA甲基結(jié)合蛋白(MBP)募集相關(guān)分子形成復(fù)合物，抑制基因表達(dá)〔2〕。DNA甲基化可以使DNA在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，堿基C(胞嘧啶)的5號碳原子上添加一個甲基的變化。在少突膠質(zhì)細(xì)胞終末分化階段中特異敲除DNA甲基結(jié)合蛋白(MeCP)2，髓鞘厚度明顯變薄，并且有研究提示MeCP2可能在少突膠質(zhì)細(xì)胞(OLs)的分化成熟和髓鞘形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用〔3〕。本研究擬闡明MeCP2在OPCs分化成熟和髓鞘形成過程中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、培養(yǎng)基與試劑 大鼠OPCs系QLN-9細(xì)胞(美國模式生物庫ATCC)，培養(yǎng)基DMEM，0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)(Gibco公司)。主要試劑:阿司匹林，順鉑，雙抗-青鏈霉素，Trizol核酸裂解液，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒(碧云天公司)。其中shRNA-MeCP2的模板序列如下：正義鏈：5'-GACTGGACCTGAGTTACGTCATTCAATAAAVCTGAAGTTCCTTACTATATGTCCTTTTTTG-3'；反義鏈：5'-CTGACTATAAAGAAGCCAAGGAAGTTGTTCTCTCTTCAAGGAATGACGTACACGTGGCTCC-3'，過程中所使用的克隆載體是pGPU5/GFP/Neo(美國Santa Cruz公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)箱二氧化碳濃度為5%、溫度37℃條件下，分別用DMEM(含10%FBS及雙抗)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠OPCs系QLN-9細(xì)胞。

1.3 提取RNA 0.25%胰蛋白酶收集對數(shù)期細(xì)胞，加入適量Trizol，冰上孵育15 min、12 000 r/min離心10 min，75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水，存于-70℃。

1.4 Western印跡檢測 一抗：tubulin配置比例為1∶10 000，MeCP2為1∶200,2'-3'-環(huán)核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP)為1∶200；二抗，Tubulin配置比例為1∶10 000,MeCP2,CNP為1∶5 000。

1.5 甲基特異性PCR 提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行甲基特異性PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40循環(huán)，72℃末次延伸5 min。取PCR結(jié)果行瓊脂糖凝膠電泳。若目的基因啟動子CPG島完全發(fā)生甲基化，則僅在完全甲基化引物下出現(xiàn)條帶；若目的基因啟動子CPG島完全不發(fā)生甲基化，則僅在無甲基化引物下出現(xiàn)條帶；若目的基因啟動子CPG島不完全發(fā)生甲基化，則兩個引物下均可出現(xiàn)條帶。

1.6 實時qPCR 提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行熒光qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40循環(huán)，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法進(jìn)行相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GRAPH PAD6.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 MeCP2沉默可促進(jìn)OPCs成熟分化 體外培養(yǎng)OPCs 1 w后，細(xì)胞逐漸由纖維狀、螺旋生長形態(tài)轉(zhuǎn)為上皮形態(tài)。與正常細(xì)胞相比，在MeCP2沉默的OPCs中，CNP蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，提示MeCP2沉默可促進(jìn)OPCs成熟分化。見圖1。

圖1 MeCP2沉默可促進(jìn)OPCs成熟分化(Western印跡)

2.2 MeCP2沉默可促進(jìn)OPCs終末分化標(biāo)志物表達(dá)及甲基化水平降低 MeCP2沉默促進(jìn)SOX10、MBP、MAG、PLP表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)；SOX10、MBP、MAG、PLP均呈現(xiàn)低甲基化水平，除SOX10外，其他均差異顯著(P<0.05)。見表1，表2。

表1 OPCs終末分化標(biāo)志物mRNA相對表達(dá)量

與對照組比較：1)P<0.05

表2 甲基特異性PCR示OPCs終末分化 標(biāo)志物甲基化水平

3 討 論

OLs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)髓鞘形成細(xì)胞。中樞神經(jīng)髓鞘的完整性保證了神經(jīng)信息精確、高效傳遞,對中樞信息整合發(fā)揮重要作用，多種神經(jīng)精神疾病如Pett綜合征(RTT)、多發(fā)性硬化癥、精神分裂癥等都有髓鞘的異常,特別是隨著年紀(jì)的增長，髓鞘的脫失與老年癡呆密切相關(guān)。OPCs分化成熟異常是導(dǎo)致髓鞘異常的直接原因。

DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)的一種表觀遺傳修飾，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基,將胞嘧啶的第5 位碳原子甲基化,使之轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶(5mC)的過程，常見于基因的CG序列。一般認(rèn)為甲基化程度高，基因的表達(dá)則低。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶包括Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b。Dnmt1，Dnmt3b對早期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要作用。Dnmt1的缺失會導(dǎo)致基因的大面積低甲基化。在Dnmt3a缺失的神經(jīng)干細(xì)胞系中，OLs相關(guān)基因比如血小板衍生生長因子受體(PDGFR)α,Olig1,SOX10,MBP,Id2/4,Nkx 2.2等表達(dá)有明顯的降低，研究發(fā)現(xiàn)〔4〕在少突膠質(zhì)譜系中Dnmt3a，Dnmt1和Dnmt3b主要在神經(jīng)元中表達(dá)。MAG基因的兩個Hpa2位點(diǎn)隨OLs分化的過程逐漸發(fā)生去甲基化。OLs分化特異的轉(zhuǎn)錄因子SOX10在精神分裂癥患者的大腦高度甲基化，SOX10低表達(dá)。從多發(fā)性硬化癥患者腦白質(zhì)分離的DNA中，發(fā)現(xiàn)OLs相關(guān)基因PAD2存在高甲基化現(xiàn)象，表達(dá)下調(diào),以上結(jié)果顯示DNA甲基化調(diào)控了OLs分化成熟和髓鞘再生障礙。

DNA甲基化的主要作用途徑是:在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，通過MBP募集組蛋白去乙?；?HDACs)、共抑制子等形成抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與其特定DNA序列結(jié)合,從而抑制基因的表達(dá)。MBP主要有MBP1～4、MeCP2和Kaiso。MeCP2位于染色體Xq28，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，MeCP2轉(zhuǎn)錄后形成 MeCP2-e1和MeCP2-e2兩種剪切體。兩種剪切體分別從外顯子1和2開始轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生的蛋白整體結(jié)構(gòu)差異微小。MeCP2外顯子1突變可導(dǎo)致典型的RTT。MeCP2蛋白有3個主要的功能域:CpG結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄抑制域和C-末端域,MeCP2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制主要通過與甲基化的DNA相互作用產(chǎn)生,由MBP區(qū)識別位于基因啟動子區(qū)的甲基化CpG雙核苷,通過轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)(TRD)募集轉(zhuǎn)錄抑制因子Sin3A和組蛋白去乙?；腹餐M成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，從而抑制下游基因表達(dá)〔5〕。

MeCP2的缺失可導(dǎo)致RTT。RTT是一種X連鎖的疾病，主要累及女孩，導(dǎo)致智力低下、類似自閉癥等神經(jīng)系統(tǒng)異常，晚期還會出現(xiàn)骨骼病變，脊柱強(qiáng)直等癥狀〔6〕，臨床上尚無有效治療藥物。RTT綜合征在發(fā)病的早期即有白質(zhì)的病變，白質(zhì)主要為神經(jīng)纖維〔7〕，而OLs正是形成神經(jīng)纖維的細(xì)胞，OLs異常是該病的重要發(fā)病機(jī)制之一。研究顯示，MeCP2敲除小鼠表現(xiàn)出與RTT相似的癥狀，MeCP2基因在OLs中恢復(fù)表達(dá)后，小鼠運(yùn)動能力明顯提升，同時相比較于MeCP2在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中恢復(fù)表達(dá)，能夠更多延長小鼠的壽命〔8～10〕。

研究發(fā)現(xiàn)MeCP2敲除小鼠的大腦胼胝體中,髓鞘厚度明顯下降〔11〕。課題組在北京師范大學(xué)章曉輝教授實驗室引進(jìn)MeCP2敲除小鼠(B6.129P2-MeCP2tm1Bird/J)，成功進(jìn)行了培育并得到了MeCP2敲除的小鼠,發(fā)現(xiàn)MeCP2敲除的小鼠髓鞘厚度顯著下降。提示MeCP2可能影響OPCs的終末分化成熟和髓鞘的形成〔12～14〕。綜上，MeCP2可能在OPCs分化的終末階段發(fā)揮了重要作用，通過調(diào)控少突終末分化相關(guān)基因的甲基化來調(diào)控OLs終末分化和髓鞘的形成。MeCP2沉默可促進(jìn)OPCs終末分化標(biāo)志物的表達(dá)及甲基化水平的降低，從而促進(jìn)OPCs成熟分化。

1 譚衛(wèi)星.miR-126-3p在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化和髓鞘再生中的作用及機(jī)制研究〔D〕.上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2015.

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3 翁 超,盧祖能,符 輝.少突膠質(zhì)細(xì)胞分化發(fā)育與髓鞘形成的研究進(jìn)展〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2016；15(5):524-8.

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〔2015-05-27修回〕

(編輯 苑云杰)

孫龍云(1981-)，男，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事人體解剖與組織胚胎學(xué)研究。

R329

A

1005-9202(2017)08-1886-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.027