馮文偉 陳伯鈞 趙 帥 唐 詠 張為章 陳冬杰 李茂清

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510403)

血管緊張素原對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制

馮文偉 陳伯鈞1趙 帥1唐 詠2張為章 陳冬杰 李茂清3

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510403)

目的 探討血管緊張素原(AGT)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的作用機(jī)制。方法 構(gòu)建AS小鼠模型，RT-PCR檢測(cè)AS小鼠斑塊組織和正常小鼠主動(dòng)脈血管組織中AGT的表達(dá)水平。以人巨噬細(xì)胞RAW264.7和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HA-VSMC)為研究對(duì)象，轉(zhuǎn)染siRNA AGT、siRNA control，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的AGT水平。MTT檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡情況。Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 AS小鼠斑塊組織中AGT的表達(dá)水平高于正常小鼠主動(dòng)脈組織(P<0.01)。siRNA AGT可以有效抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HA-VSMC中AGT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的巨噬細(xì)胞RAW264.7存活率與siRNA control組比較差異顯著(P<0.01)，轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HA-VSMC存活率與siRNA control組差異顯著(P<0.01)，抑制AGT的表達(dá)可以抑制巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡率顯著高于siRNA control組(P<0.01)；轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HA-VSMC凋亡率顯著高于siRNA control組(P<0.01)。轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的巨噬細(xì)胞RAW264.7和主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HA-VSMC中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量顯著高于siRNA control組，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著低于siRNA control組(均P<0.01)。結(jié)論 AGT在鼠AS斑塊組織中過(guò)表達(dá)，抑制AGT可以抑制AS相關(guān)細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化；血管緊張素原；平滑肌細(xì)胞；巨噬細(xì)胞

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生和發(fā)展與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMC)和巨噬細(xì)胞具有密切關(guān)系〔1〕。血管緊張素原(AGT)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)唯一的作用底物〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，AS在心血管系統(tǒng)中具有重要作用〔3〕。目前尚未見(jiàn)AGT在AS中的相關(guān)作用研究。本研究構(gòu)建了動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，檢測(cè)斑塊組織中AGT的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究AGT對(duì)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人巨噬細(xì)胞RAW264.7和人VSMC(HA-VSMC)購(gòu)于上海昱都生物科技有限公司，14日齡的載脂蛋白E(ApoE)基因敲除(ApoE-/-)雄性小鼠8只為正常組，14日齡雄性小鼠8只為實(shí)驗(yàn)組，均由長(zhǎng)沙天力生物科技有限公司提供。正常組每日正常飲食，實(shí)驗(yàn)組用高脂飼料飼喂，兩組小鼠均按照相關(guān)管理要求飼喂30 d。主要儀器及試劑：酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，DMEM(美國(guó)Sigma)，勻漿器(上海洽姆儀器科技有限公司)，離心機(jī)(湖南恒諾醫(yī)用設(shè)備有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，F(xiàn)BS(樂(lè)清市虹橋愛(ài)科威自動(dòng)化設(shè)備廠)，聚偏氟乙醇(PVDF)膜(上海康朗生物科技有限公司)，脫脂奶粉(雅培)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)，PBS(上海欣百諾生物工程有限公司)，MTT(上海江萊生物科技有限公司)，PI(北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司)，Annexin-V(北京創(chuàng)根勝泰科技有限公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma)，Bax多克隆抗體、Bcl-2多克隆抗體、Caspase-3多克隆抗體、β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)AGT的表達(dá)水平 誘導(dǎo)的AS小鼠斷頭處死，打開(kāi)胸腔，取主動(dòng)脈斑塊組織，經(jīng)勻漿器勻漿后，5 000 r/min，4℃離心5 min后棄上清液，加入冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，5 000 r/min，4℃離心5 min，棄上清液，加入Trizol裂解液充分混勻后，放置于冰上靜置5 min。加入氯仿，上下劇烈震蕩10次，放置于冰上靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，吸取上層水相層至新的EP管中，加入等體積的異丙醇充分混勻后，放置于冰上靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清液，加入濃度為75%的乙醇混勻，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，放置于超凈工作臺(tái)晾干后，加入適量的焦碳酸乙醇酯(DEPC)水溶解RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度及純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成AGT的cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR說(shuō)明書(shū)檢測(cè)AGT的表達(dá)水平，分析AGT的表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人巨噬細(xì)胞RAW264.7和HA-VSMC細(xì)胞用含10% FBS的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞融合度為85%左右時(shí)，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加入PBS洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人巨噬細(xì)胞RAW264.7和HA-VSMC，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，調(diào)整每毫升細(xì)胞懸浮液中含有細(xì)胞個(gè)數(shù)為3×105個(gè)，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。為了提高轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染前1 h將細(xì)胞生長(zhǎng)液換成不含F(xiàn)BS的不完全培養(yǎng)基。分別取siRNA AGT、siRNA control與不完全培養(yǎng)液混合為A液，于室溫靜置5 min；轉(zhuǎn)染試劑與不完全培養(yǎng)基混合后為B液；分別取A液和B液混合后室溫靜置20 min后，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中AGT的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染siRNA AGT、siRNA control后的RAW264.7和HA-VSMC細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)48 h后，提取其細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成AGT的cDNA，RT-PCR檢測(cè)分析細(xì)胞中AGT的表達(dá)水平，方法同1.2.2。

1.2.5 (MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7和HA-VSMC細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml，接種細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸浮液200 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h，棄上清液，加入150 μl的二氨基亞砜(DMSO)溶液，緩慢震蕩10 min，觀察結(jié)晶完全溶解后，放置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的吸光度，波長(zhǎng)為490 nm，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染后的RAW264.7和HA-VSMC細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，棄消化液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升中含有2×106個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，加入冰預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入體積為200 μl的Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl碘化丙啶(PI)和5 μl膜鏈蛋白(Annexin-V)充分混勻后，在室溫下靜置15 min，加入體積為300 μl的緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)染后的RAW264.7和HA-VSMC，棄細(xì)胞生長(zhǎng)液，按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中的總蛋白，用蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定提取的蛋白的濃度及純度。蛋白樣品與loading buffer充分混勻后，放置于100℃煮沸5 min。取變性后的蛋白樣品50 μl，加入上樣孔中，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V直至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠，按照濾紙、PVDF膜、蛋白凝膠、濾紙順序放置，轉(zhuǎn)膜電流為30 mA，4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。5%脫脂奶粉封閉后，依次與一抗和二抗孵育后，在暗室中曝光，分析蛋白表達(dá)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 AS小鼠組織中AGT的表達(dá)水平 AS小鼠斑塊組織中AGT的表達(dá)水平(2.14±0.22)與正常小鼠主動(dòng)脈組織AGT的水平(1.01±0.68)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中AGT表達(dá)結(jié)果 轉(zhuǎn)染后的RAW264.7 siRNA AGT組中AGT的表達(dá)水平(0.23±0.12)明顯低于siRNA control組(1.00±0.85)(P<0.01)；轉(zhuǎn)染后的HA-VSMC siRNA AGT組AGT的表達(dá)水平(0.32±0.04)明顯低于siRNA control組(1.05±0.88)(P<0.01)，siRNA AGT可以有效抑制RAW264.7和HA-VSMC中AGT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

2.3 MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況 轉(zhuǎn)染siRNA AGT后RAW264.7存活率〔(0.34±0.04)%〕與siRNA control組〔(0.99±0.08)%〕比較差異顯著(P<0.01)，轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的HA-VSMC存活率〔(0.28±0.03)%〕與siRNA control組〔(1.00±0.07)%〕差異顯著(P<0.01)，抑制AGT的表達(dá)可以抑制巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的RAW264.7凋亡率〔(0.53±0.07)%〕顯著高于siRNA control組〔(0.14±0.06)%〕(P<0.01)；轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的HA-VSMC凋亡率〔(0.62±0.06)%〕顯著高于siRNA control組〔(0.18±0.04)%〕(P<0.01)；抑制AGT的表達(dá)可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡。

2.5 Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染siRNA AGT后RAW264.7中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量(0.29±0.05，0.36±0.06)顯著高于siRNA control組(0.14±0.03，0.25±0.07)，Bcl-2蛋白表達(dá)量(0.08±0.01)顯著低于siRNA control組(0.28±0.04)(均P<0.01)；轉(zhuǎn)染siRNA AGT后的HA-VSMC中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量(0.31±0.08，0.45±0.07)顯著高于siRNA control組(0.13±0.02，0.24±0.09)，Bcl-2蛋白表達(dá)量(0.15±0.09)顯著低于siRNA control組(0.36±0.08)(均P<0.01)。抑制AGT的表達(dá)可以抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3、Bax表達(dá)。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7中蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)HA-VSMC中蛋白表達(dá)

3 討 論

AS是最為常見(jiàn)的心血管系統(tǒng)疾病〔4〕。AS會(huì)引起血管壁增厚使管腔變窄，增加血管壓力，進(jìn)而引起高血壓的發(fā)生。平滑肌細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集增生是AS形成的必要條件。

RAS廣泛存在于人體的心臟、腎臟、腎上腺、血管等組織系統(tǒng)中，在心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定和正常發(fā)育以及血壓調(diào)節(jié)、維持體液平衡等方面發(fā)揮重要作用〔6〕。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，腎素和AGT的主要來(lái)源為腎臟，研究表明，AGT和腎素在骨骼肌、血管平滑肌、心肌、腦等多種組織器官中均有表達(dá)〔7〕。RAS在心血管系統(tǒng)中存在局部循環(huán)，這種局部循環(huán)可以調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的活動(dòng)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在人體內(nèi)，AGT是一種糖基化的球蛋白，由452個(gè)氨基酸組成，是RAS的作用底物，在腎素的作用下可以分解為血管緊張素Ⅰ，從而引起一系列的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)〔8〕。本研究結(jié)果說(shuō)明抑制AGT的表達(dá)可

以抑制VSMC和巨噬細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡是一種正常情況下的細(xì)胞死亡，是細(xì)胞維持生命機(jī)體活動(dòng)的重要功能。細(xì)胞凋亡受多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，是一種程序性的細(xì)胞死亡，是細(xì)胞維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要途徑〔9〕。Bcl-2蛋白家族與細(xì)胞的凋亡具有密切關(guān)系，根據(jù)其在細(xì)胞凋亡中的作用可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)是可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白稱(chēng)為促凋亡蛋白，主要有Bax，還有一類(lèi)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮抑制作用的蛋白如Bcl-2蛋白〔10〕。細(xì)胞凋亡時(shí)，促凋亡蛋白增多，抑凋亡蛋白減少。Caspase-3作為Caspase蛋白家族中的成員之一，是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志之一〔11〕。本研究結(jié)果說(shuō)明AGT可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與Bcl-2、Bax和Caspase-3有關(guān)。

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〔2016-12-12修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省立項(xiàng)資助項(xiàng)目(20151114)

陳伯鈞(1962-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病臨床與基礎(chǔ)研究。

馮文偉(1979-)，男，2015級(jí)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西結(jié)合治療心血管疾病臨床與基礎(chǔ)研究。

R543.5

A

1005-9202(2017)08-1871-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.021

1 廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院急診科

2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院心血管科

3 梅州市殘聯(lián)康復(fù)醫(yī)院康復(fù)科