王建偉 李 佳 曹利艷 米 琰 劉曉飛 張 馳 孫偉鵬

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450008)

七氟烷復合咪達唑侖麻醉對老年大鼠認知功能的影響及其機制

王建偉 李 佳 曹利艷 米 琰 劉曉飛 張 馳1孫偉鵬1

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450008)

目的 探討七氟烷復合咪達唑侖麻醉對老年大鼠認知功能的影響及其機制。方法 將64只SD大鼠隨機分為對照組(C組)、七氟烷組(S組)、咪達唑侖組(M組)、七氟烷復合咪達唑侖組(S+M組)，每組大鼠16只，處理后采用Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠認知功能的變化以及各組大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體(NR)1、NR2B mRNA表達情況、各組大鼠海馬神經型一氧化氮合酶(nNOS)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白表達。結果 Morris水迷宮實驗訓練1 d，各組大鼠潛伏期比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，訓練3 d、5 d，各麻醉組大鼠潛伏期均顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且S+M組大鼠潛伏期明顯高于S組及M組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；將平臺撤除后，各麻醉組大鼠60 s內穿過平臺次數明顯低于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且S+M組大鼠穿過平臺次數明顯低于S組及M組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各組大鼠海馬NR1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，S組與S+M組大鼠海馬NR2B mRNA相對表達量較C組、M組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，M組與C組大鼠海馬NR2B mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與C組比較，各麻醉組大鼠海馬nNOS蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義，且S+M組大鼠海馬nNOS蛋白表達量最低，而各組大鼠海馬caspase-3蛋白表達情況無明顯變化，差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 七氟烷復合咪達唑侖可引起大鼠認知功能的降低，其機制可能與抑制NR2B、NOS表達有關，而與神經細胞凋亡無明顯關系。

七氟烷；咪達唑侖；認知功能

老年患者術后更易出現(xiàn)人格的改變、記憶力的降低、情緒異常及精神錯亂等相關表現(xiàn)〔1,2〕。而這種術后所出現(xiàn)的一系列變化成為術后認知功能障礙(POCD)〔3〕。七氟烷作為一種吸入性麻醉藥物，其誘導和蘇醒期平穩(wěn)，具有較強的麻醉效力，且對患者肝腎功能的影響較小，是目前臨床上廣泛使用的一種麻醉藥物〔4〕。本研究探討七氟烷復合咪達唑侖對老年大鼠認知功能的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取12月齡健康SD大鼠64只，雄性，體質量550～600 g，實驗動物由鄭州大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 吸入用七氟烷(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，H20070172)、咪達唑侖(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，H20031037)、RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)、RT-PCR試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京天德悅生物科技有限責任公司)、Caspase-3 抗體(Abcam)、神經型一氧化氮合酶(nNOS)抗體(Abcam)、HRP標記的山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術有限公司)、引物合成有北京奧科生物技術有限公司完成。Morris恒溫水迷宮(張家港市生物醫(yī)學儀器廠)、DY-89 Ⅱ型電動玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 造模方法及分組 按照隨機數字表法將大鼠分為對照組(C組)、七氟烷組(S組)、咪達唑侖組(M組)、七氟烷復合咪達唑侖組(S+M組)，每組各16只，動物均適應性飼養(yǎng)1 w，讓其自由取食飲水，溫度22℃，濕度60%～80%。S組、S+M組置于自制的有機玻璃麻醉箱內進行麻醉，對大鼠進行七氟烷吸入麻醉，箱內七氟烷濃度為3.0%，麻醉時間為2 h。C組與M組自由呼吸空氣，M組腹腔注射5 mg/kg咪達唑侖，待S+M組從麻醉箱內取出后腹腔注射5 mg/kg咪達唑侖，C組及S組則給予等體積生理鹽水腹腔注射。待各組恢復清醒后放置會動物房常規(guī)飼養(yǎng)，麻醉處理后的24 h各組隨機抽取8只斷頭處死，在無菌錫箔紙覆蓋的冰袋上分離大鼠海馬，然后置于液氮中24 h，再轉至-80℃冰箱內凍存?zhèn)溆?。各組剩余大鼠則于麻醉后24 h開始進行Morris水迷宮實驗。

1.4 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮是一個直徑120 cm、水深50 cm的圓形鐵皮水池。池壁上分布東、南、西、北四個入水點，水池的南北、東西連線將水池分為4個象限，在第4象限正中池壁處放置與水池背景同色的平臺，水面較平臺高出3 cm。在水中放入脫脂奶粉，使水變渾濁，以隱藏水下的平臺，水溫控制在(24±1)℃。同時為了視頻追蹤的需要，在水迷宮中央正上方2 m處放置一臺攝像機，以記錄動物在水池中的位置、運行的速度以及運動的軌跡。定位航行實驗：從任一象限開始，將大鼠按照順時針方向依次放入4個象限，記錄大鼠找到平臺的時間即為潛伏期，若大鼠在60 s內仍未找到平臺，則將大鼠直接引導至平臺上，并讓大鼠在平臺上適應性停留10 s，且此次實驗潛伏期計為60 s。定位航行實驗歷時5 d，取每日平均值作為大鼠潛伏期成績?？臻g探索實驗：實驗第6天撤去平臺，記錄大鼠在60 s內穿過平臺的次數。

1.5 RT-PCT檢測大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)受體NR1、NR2B mRNA表達 各組大鼠分離后的海馬組織采用RT-PCR法檢測NR1、NR2B mRNA相對表達量。采用Primer 5.0軟件設計引物，引物設計如下：NR1(328 bp)上游5'-TCGGTATCAGGAATGCG-3'，下游5'-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3'；NR2B(381 bp)上游5'-GCTCAGCGACCTGTATGG-3'，下游5'-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3'；β-actin(448 bp)上游5'-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3'。RNA提取參照試劑盒使用說明書進行，PCR反應條件為NR1：94℃ 45 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s，共34個循環(huán)；NR2B：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 45 s，共34個循環(huán)；β-actin：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 45 s，共30個循環(huán)。擴增產物進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀下觀察電泳結果，采用Image J分析軟件處理圖像，以目標基因條帶綜合光密度與β-actin條帶光密度之間的比值作為目標基因的相對含量。

1.6 Western印跡檢測大鼠海馬nNOS、caspase-3蛋白表達 分離后的海馬組織內加入蛋白提取試劑，4℃條件下離心15 min(12 000 r/min)，并按照BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。配制8%/10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再將蛋白電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉粉筆1 h后加入一抗(分別為1∶2 000稀釋的nNOS與1∶4 000稀釋的Caspase-3抗體)，4℃孵育過夜；TBST洗滌3次，HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL化學發(fā)光，曝光。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析及LSD檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期比較 Morris水迷宮實驗訓練1 d，各組潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，訓練3 d、5 d，各麻醉組潛伏期均顯著高于C組(P<0.05)，且S+M組大鼠潛伏期明顯高于S組及M組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期比較

與C組比較：1)P<0.05；與S組比較:2)P<0.05；與M組比較:3)P<0.05，下表同

2.2 各組Morris水迷宮實驗60 s內穿過平臺的次數 將平臺撤除后，S組、M組及S+M組麻醉組60 s內穿過平臺次數分別為(3.73±1.25)、(4.16±1.09)、(2.36±0.85)次，均明顯低于C組(P<0.05)，且S+M組大鼠穿過平臺次數明顯低于S組及M組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠海馬NR1、NR2B mRNA表達情況 各組海馬NR1 mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，S組與S+M組海馬NR2B mRNA相對表達量較C組、M組顯著降低(P<0.05)，M組與C組大鼠海馬NR2B mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4 各組海馬nNOS、caspase-3蛋白表達情況 與C組比較，各麻醉組海馬nNOS蛋白表達顯著降低(P<0.05)，且S+M組海馬nNOS蛋白表達量最低，而各組大鼠海馬caspase-3蛋白表達情況無明顯變化(P>0.05)，見圖1。

表2 各組大鼠海馬NR1、NR2B mRNA 相對表達量

圖1 各組大鼠海馬nNOS、caspase-3蛋白表達

3 討 論

研究證明〔5，6〕，全身麻醉后大腦發(fā)生了基因表達改變、神經元凋亡等廣泛而持久的變化，短時間的單純麻醉即可造成實驗動物長時間的認知功能障礙，臨床上則主要表現(xiàn)為POCD，其中以老年患者尤為多見。相關調查顯示〔7〕，10%～14%的老年患者，經全身麻醉手術后可發(fā)生長期的認知功能障礙。七氟烷吸入麻醉是否能引起患者POCD，目前尚無統(tǒng)一的認識，左蕾等〔8〕認為七氟烷對大鼠認知功能的影響具有一定的劑量依賴性，濃度越高則對大鼠認知功能的影響更為嚴重。

Morris水迷宮實驗作為研究空間學習記憶的經典實驗，不僅能夠反映動物的空間認知，同時還能夠有效評價藥物干預后對動物學習記憶能力的變化〔9〕。本研究表明七氟烷或咪達唑侖麻醉均對老年大鼠的認知功能具有一定的影響，其中七氟烷復合咪達唑侖對大鼠認知功能的影響更嚴重。

NR1是NMDAR受體復合物的功能性亞單位，而NMDAR介導一系列高級的神經活動，是構成中樞神經系統(tǒng)學習記憶功能的重要基礎，NR1含量可代表NMDA的總量〔10〕。NR2B則是NMDAR調節(jié)亞單位，NR2B水平可反映NR受體功能的變化情況〔11〕。本研究表明七氟烷復合咪達唑侖降低海馬區(qū)NR2B mRNA的表達，提示NR2B表達降低可能與大鼠認知功能降低之間具有密切的聯(lián)系，這與以往的報道結果相一致〔12〕。

一氧化氮(NO)作為一種神經遞質，在神經元之間起著信息傳遞的作用，尤其在學習記憶過程當中發(fā)揮著重要作用〔13〕。由于NO具有不穩(wěn)定性，目前一般多為一氧化氮合酶(NOS)表示機體內NO活性，相關研究發(fā)現(xiàn)〔14〕，老年大鼠記憶減退與其海馬區(qū)NOS表達降低有關。本研究結果表明七氟烷復合咪達唑侖對鼠認知功能的影響可能與抑制機體NO活性有關。目前一般認為細胞凋亡是一系列高度調控的caspase級聯(lián)反應的結果，其中caspase-3可有效反映細胞凋亡情況〔15〕，本研究表明七氟烷復合咪達唑侖麻醉對大鼠神經細胞的凋亡影響不大。

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〔2016-12-35修回〕

(編輯 曹夢園)

河南省醫(yī)學科技攻關計劃(No.122300410408)

王建偉(1973-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事疼痛學研究。

R6

A

1005-9202(2017)08-1864-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.018

1 鄭州大學醫(yī)學院