馬海涵 邵志成 陳力學(xué) 邵 陽

(解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450042)

二苯乙烯苷對血管性癡呆大鼠室管膜細(xì)胞增殖的影響

馬海涵 邵志成1陳力學(xué)1邵 陽2

(解放軍第153中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450042)

目的 探討二苯乙烯苷(TSG)對血管性癡呆(VD)大鼠海馬血流量和腦室管膜細(xì)胞變化的影響。方法 實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、TSG組，后兩組采用4血管阻斷法(4-VO法) 建立VD大鼠模型。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程與模型組相同，但不電凝雙側(cè)椎動脈，不阻斷雙側(cè)頸總動脈。水迷宮法評價行為學(xué)。應(yīng)用氫清除法檢測大鼠海馬血流量。用5-溴脫氧尿核苷(BrdU)免疫熒光染色，顯微鏡下觀察室管膜下區(qū)(SVZ)干細(xì)胞增殖。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力下降，表現(xiàn)為游全程時間延長，錯誤次數(shù)增加(P<0.01)。手術(shù)后7 d，與模型組比較，TSG組海馬血流量明顯提高和腦室管膜BrdU免疫熒光染色陽性細(xì)胞明顯增加(P<0.01)。結(jié)論 TSG可改善VD大鼠海馬血流量和促進(jìn)腦室管膜細(xì)胞增殖。

二苯乙烯苷；血管性癡呆；海馬血流量；腦室管膜細(xì)胞

研究證實(shí)成體動物腦室管膜下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回(SGZ)神經(jīng)前體細(xì)胞可以再生，腦缺血后可以激活SVZ區(qū)細(xì)胞的增殖，但腦缺血后腦內(nèi)微環(huán)境不太適于增殖細(xì)胞的存活以及向神經(jīng)元方向分化。改善腦內(nèi)微環(huán)境如血流動力學(xué)變化等因素，可能有利于SVZ區(qū)細(xì)胞增殖和分化〔1〕。二苯乙烯苷(TSG)是何首烏的主要成分之一，能夠抑制生物膜脂質(zhì)的過氧化，提高機(jī)體超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔2,3〕。但TSG能否改善腦組織血流量和促進(jìn)SVZ區(qū)細(xì)胞增殖報道較少。本研究觀察TSG對血管性癡呆(VD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶、腦組織血流量和SVZ區(qū)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、動物及分組 TSG(本室自制，HPLC測定純度為90%)。健康SD大鼠30只，3～4月齡，雄性，體重200～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、TSG組。TSG組灌胃TSG 60 mg·kg-1·d-1，5 d/w，連續(xù)4 w，假手術(shù)組與模型組均灌胃等容量生理鹽水；造模共6 w后，開始測定。

1.2 模型的建立 采用大鼠四血管阻斷法(4-VO法)制成血管性癡呆大鼠模型：將大鼠用10% 的水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上；常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈。用4號絲線結(jié)扎。拉緊絲線，同時在距尾尖1 cm處剪斷放血約0.3 ml，熱凝止血。阻斷血流20 min，松開絲扣再灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，第2次再灌后觀察30 min，縫合皮膚，切口局部注射慶大霉素0.2萬U。假手術(shù)組只分離頸總動脈，穿線但不結(jié)扎，尾部不放血。

1.3 行為學(xué)檢測 采用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠記憶功能的測定。Morris水迷宮由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)，為一不銹鋼的圓形水池，直徑150 cm，高50 cm。池壁標(biāo)明4個入水點(diǎn)，由此將水池等分為4個象限，任選其中1個象限，正中放置1個直徑14 cm、高29 cm的平臺。測試程序?yàn)槎ㄎ缓叫性囼?yàn)：歷時5 d，每天上、下午各2次，將大鼠面向池壁分別從4個入水點(diǎn)放入水中，記錄其在3 min內(nèi)尋找到并爬上平臺的時間即逃避潛伏期。分別在術(shù)后4、8 w重新進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，大鼠每次在3 min內(nèi)尋找到并爬上平臺的時間為大鼠的記憶成績，2次/d，連續(xù)5 d，計算平均成績。

1.4 腦組織血流量測定〔4〕按照大鼠腦立體定位圖譜，應(yīng)用氫清除法的測定：應(yīng)用氫清除法檢測大鼠海馬血流量。記錄電極插入矢狀縫旁開2 mm、深3.5 mm、前囟向后2.8 mm處，參考電極放于皮下顳肌旁，大鼠以呼吸機(jī)輔助呼吸(70次/min，潮氣量2 ml)，待描筆穩(wěn)定后經(jīng)氣管插管吸入10 %的氫氣1 min，記錄完整的清除曲線。根據(jù)公式計算皮層局部血流量。

1.5 BrdU標(biāo)記法 各組大鼠于處死前兩天按100 mg/kg 腹腔注射BrdU生理鹽水液(Sigma公司提供),每日2 次。BrdU免疫熒光染色麻醉動物。4%多聚甲醛400 ml經(jīng)左心室灌注后，斷頭取腦，置4%多聚甲醛后固定24 h，冠狀位切取以缺血區(qū)域?yàn)橹行牡陌▊?cè)腦室室管膜下區(qū)的腦組織標(biāo)本，冰凍切片，片厚5 μm，進(jìn)行BrdU免疫熒光染色，顯微鏡下觀察SVZ區(qū)干細(xì)胞增殖情況。并在200倍鏡下，每只大鼠選5張切片，每張切片取4個視野(單位面積) 計數(shù)SVZ區(qū)缺血側(cè)和缺血對側(cè)的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)變化 與假手術(shù)組比較，模型組的游全程時間逐漸延長，錯誤次數(shù)逐漸增加(均P<0.01)。與模型組比較，TSG組學(xué)習(xí)成績和記憶成績均有顯著提高(均P<0.01)，表明TSG有提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用，見表1。

表1 TSG對VD模型大鼠水迷宮學(xué)習(xí)成績影響

與模型組比較:1)P<0.05

2.2 海馬血流量的變化 模型制作后7 d，與假手術(shù)組〔(48.5±7.2)ml·min-1·100 g-1〕比較，模型組〔(25.5±3.7)ml·min-1·100 g-1〕和TSG組〔(33.45±3.35)ml·min-1·100 g-1〕海馬血流量明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，TSG組海馬血流量明顯升高(P<0.01)，表明TSG有提高海馬血流量的作用。

2.3 SVZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)的變化 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組和TSG組模型雙側(cè)SVZ區(qū)均可見BrdU陽性細(xì)胞，

表2 TSG對VD模型大鼠SVZ區(qū)細(xì)胞增殖的 作用,個/點(diǎn),n=10)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

主要分布在側(cè)腦室背外側(cè)角和外側(cè)壁。假手術(shù)組的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量少，呈散在分布；模型組和TSG組模型大鼠在手術(shù)后3 d，BrdU陽性細(xì)胞明顯增多，7 d時達(dá)到峰值，之后逐漸減少。與模型組比較，TSG組BrdU陽性細(xì)胞明顯升高(P<0.01)，表明TSG有促進(jìn)SVZ區(qū)細(xì)胞增殖的作用。

3 討 論

由于腦組織反復(fù)缺血，導(dǎo)致海馬、基底神經(jīng)結(jié)及皮層等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆性損傷，隨之出現(xiàn)癡呆癥狀〔5,6〕。研究顯示氧化損傷是導(dǎo)致VD的重要病理因素，腦缺血發(fā)生后，缺血缺氧的腦組織通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、花生四烯酸-環(huán)氧酶系統(tǒng)及線粒體等途徑產(chǎn)生大量自由基，由于腦組織生物膜中含有大量的多聚不飽和脂肪酸，因此腦對自由基損害尤為敏感〔7〕。因此自由基的毒性作用已被認(rèn)為腦缺血損害導(dǎo)致VD的關(guān)鍵性病理環(huán)節(jié)之一。研究表明，TSG能夠抑制生物膜脂質(zhì)的過氧化，提高機(jī)體SOD的活性，從而抑制機(jī)體氧應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生，對VD模型大鼠在學(xué)習(xí)和記憶能力等行為學(xué)以及自由基代謝的產(chǎn)生影響〔3，4，8，9〕。本研究表明TSG能夠促進(jìn)海馬組織微循環(huán)，提高再灌注，促進(jìn)SVZ區(qū)細(xì)胞增殖，改善VD大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力。

1 Kojima T,Hirota Y,Ema M,etal.Subventricular zone-derived neural progenitor cells migrate along a blood vessel scaffold toward the post-stroke striatum〔J〕.Stem Cells,2010;28(3):545-54.

2 Glodzik L,Rusinek H,Pirraglia E,etal.Blood pressure decrease correlates with tau pathology and memory decline in hypertensive elderly〔J〕.Neurobiol Aging,2014;35(1):64-71.

3 Um MY,Choi WH,Aan JY,etal.Protective effect of polygonum multiflorum thromb on amyloid beta-peptide 25-35 induced cognitive deficits in mice〔J〕.J Ethnopharmacol,2006;104(1-2):144-8.

4 Li RP,Wang ZZ,Sun MX,etal.Polydatin protects learning and memory impairments in a rat model of vascular dementia〔J〕.Phytomedicine,2012;19(8-9):677-81.

5 Zimny A,Leszek J,Kiejna A,etal.Analysis of correlation between the degree of cognitive impairment and the results of perfusion CT in patients with dementia〔J〕.Med Sci Monit,2007;13(1):23-30.

6 Tang Z,Pi X,Chen F,etal.Fifty percent reduced-dose cerebral CT perfusion imaging of Alzheimer′s disease:regional blood flow abnormalities〔J〕.Am J Alzheimers Dis Other Dement,2012;27(4):267-74.

7 Moneim AE.Oxidant/antioxidant imbalance and the risk of Alzheimer's disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2015;12(4):335-49.

8 Zhang L,Yu S,Zhang R,etal.Tetrahydroxystilbene glucoside antagonizes age-related α-synuclein overexpression in the hippocampus of APP transgenic mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.Restor Neurol Neurosci,2013;31(1):41-52.

9 Zhou L,Hou Y,Yang Q,etal.Tetrahydroxy stilbene glucoside improves the learning and memory of amyloid-β(1-42)-injected rats and may be connected to synaptic changes in the hippocampus〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2012;90(11):1446-5.

〔2015-05-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

四川省杰出青年學(xué)科帶頭人培養(yǎng)基金資助(05ZQ026-020)；四川省科技攻關(guān)項(xiàng)目資助(05SG1866)

邵 陽(1968-),男,博士,教授,主要從事神經(jīng)疾病發(fā)病機(jī)制研究。

馬海涵(1972-)，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

R255.2

A

1005-9202(2017)08-1862-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.017

1 重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 2 南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科