王海妹 周學(xué)軍 黃家軍 周小柳

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，海南 ?？?570102)

老年喉癌組織中人乳頭狀瘤病毒E7及腫瘤增殖、遷移相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的檢測及臨床意義

王海妹 周學(xué)軍 黃家軍 周小柳

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，海南 ?？?570102)

目的 檢測老年喉癌組織中增殖、遷移相關(guān)基因及人乳頭狀瘤病毒(HPV)E7 mRNA表達(dá)量并分析其臨床意義。方法 經(jīng)臨床明確診斷的喉癌、喉癌前病變、聲帶息肉患者共計(jì)88例，分為喉癌組、病變組、息肉組3組，分別擴(kuò)增目的基因絲氨酸豐富剪接因子(SRSF)1、重組人微管解聚蛋白(STMN)1、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MACC)1、生存素(Survivin)、β-鏈蛋白(catenin)、E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、紅細(xì)胞波形蛋白纖維(Vimentin)、CD44v6、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1、Beclin1及內(nèi)參基因GAPDH，計(jì)算其mRNA含量。結(jié)果 喉癌組HPV-16 及HPV-18 的E7 mRNA含量均顯著高于病變組和息肉組(P<0.05)；喉癌組織中增殖基因SRSF1、STMN1、MACC1、Survivin的mRNA含量顯著高于病變及息肉組(P<0.05)；喉癌組織中E-cadherin、β-catenin的mRNA含量顯著低于病變組和息肉組(P<0.05)；喉癌組織中N-cadherin、Vimentin、CD44v6、MMP-9的mRNA含量顯著高于病變組和息肉組(P<0.05)；喉癌組織中Caspase-1、Beclin1的mRNA含量均顯著低于病變組和息肉組(P<0.05)。結(jié)論 喉癌組織中HPV mRNA表達(dá)量異常升高，并與喉癌細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)基因表達(dá)量相關(guān)。檢測HPV E7 mRNA可以為喉癌的預(yù)防、發(fā)展監(jiān)測提供重要的臨床指導(dǎo)。

人乳頭瘤病毒;反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);mRNA表達(dá);喉癌

組織學(xué)上可將喉癌分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌等類型，最多見的是鱗狀細(xì)胞癌，占喉癌總數(shù)95%～98%〔1〕。在臨床上喉癌可分為聲門下型、聲門型及聲門上型，其中聲門型喉癌最多見，30%～40%的喉癌為該類型。與頭頸部的其他腫瘤相比，雖然喉癌的轉(zhuǎn)移率相對較低，但是喉癌患者5年中死亡的主要原因仍然是轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)〔2～4〕。導(dǎo)致老年喉癌患者患病的最主要因素是吸煙及飲酒，除了酒精及煙草的使用以外，通過流行病學(xué)證實(shí)，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)是部分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的病原體。為了更加有效地預(yù)防喉癌的發(fā)生，研究喉癌的具體病因是非常重要的〔5,6〕。由于HPV E6、E7蛋白與基因的產(chǎn)物P105RB結(jié)合，導(dǎo)致活性被抑制，pRb基因的丟失及失活或突變引起細(xì)胞周期的失控，使G1期進(jìn)入S期細(xì)胞增多，造成細(xì)胞分裂周期的紊亂，致使被感染的細(xì)胞永生化。研究表明HPV E6、E7表達(dá)的增加與喉癌的發(fā)生具有相關(guān)性〔7～9〕。本研究主要探討老年喉癌組織中HPV E7 mRNA表達(dá)量及其與喉癌細(xì)胞生長的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年1～3月我院經(jīng)臨床明確診斷的喉癌、喉癌前病變、聲帶息肉患者共計(jì)88例分為喉癌組、病變組、息肉組3組，年齡60～80歲，平均(72.8±11.9)歲。其中喉癌組50例，男26例，女24例，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例；病變組22例，男12例，女10例，成人型喉乳頭狀瘤3例，聲帶白斑5例，不同程度非典型增生的慢性肥厚性喉炎6例，淀粉樣變8例；息肉組16例，男9例，女7例；均于本院進(jìn)行喉組織活檢，由技術(shù)精湛的臨床醫(yī)生操作，所取組織部分用于病理診斷,其余部分凍存于液態(tài)氮中，用于抽提mRNA。均知情同意。各組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 標(biāo)本收集保存方法 手術(shù)切除喉癌、癌前病變及聲帶息肉后30 min內(nèi)，切取適量腫瘤組織，用生理鹽水清洗3～5遍，保證組織表面無血液殘留。而后將組織裁剪為1 cm×1 cm×1 cm的組織塊，轉(zhuǎn)移入凍存管，并放置在液態(tài)氮中20～30 min短暫冷凍后，取出凍存管，保存于-80℃冰箱。

1.3 HPV mRNA提取 首先從液氮中取出50 mg凍存組織塊，用小剪刀將組織盡量剪碎，在研缽中用研磨棒充分研磨，后移入玻璃勻漿器中。移入1.5 ml Eppendorf管中并加入1 ml Trizol，反復(fù)吹吸進(jìn)行勻漿，置于冰上孵育5 min，在4℃下12 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至1.5 ml離心管并加入氯仿0.2 ml，劇烈震蕩。置于冰上孵育5 min，再于4℃下12 000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管并加入異丙醇0.5 ml，充分震蕩。置冰上孵育5 min，在4℃下12 000 r/min離心5 min。小心將上清液棄除，加入75%的乙醇1 ml，充分震蕩后在4℃下7 500 r/min離心5 min。小心將上清液棄除，于室溫下放置10 min干燥。沿管壁緩慢加入10 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，將RNA溶解。取2 μl RNA置于1%瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳及照相〔9,10〕。OD值選用紫外分光光度計(jì)檢測，檢測RNA是否具有高純度(高純度標(biāo)準(zhǔn)：OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0)。根據(jù)檢測的OD值計(jì)算RNA濃度，調(diào)整其最終濃度至100 ng/μl后，立即置于-70℃冰箱中保存。

1.4 目的基因檢測方法 取喉癌、癌前病變及聲帶息肉組織，加入Trizol裂解液并充分研磨組織，采用RNA抽提試劑盒提取組織樣本和細(xì)胞樣本中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈后進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，分別擴(kuò)增目的基因絲氨酸豐富剪接因子(SRSF)1、重組人微管解聚蛋白(STMN)1、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MACC)1、生存素(Survivin)、β-鏈蛋白(catenin)、E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、紅細(xì)胞波形蛋白纖維(Vimentin)、CD44v6、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1、Beclin1及內(nèi)參基因GAPDH，得到擴(kuò)增曲線后，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算上述基因的mRNA含量〔11〕。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組HPV E7 mRNA及增殖相關(guān)基因的mRNA含量比較 病變及息肉組HPV-16及HPV-18的E7 mRNA含量、增殖基因RSF1、STMN1、MACC1、Survivin的mRNA及含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；喉癌組HPV-16及HPV-18的E7 mRNA及SRSF1、STMN1、MACC1、Survivin的mRNA含量均明顯高于病變及息肉組(均P<0.05)。見表1。

2.2 各組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因的mRNA含量比較 病變及息肉組β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的mRNA含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；喉癌組E-cadherin、β-catenin的mRNA含量顯著低于病變組和息肉組(均P<0.05)；喉癌組Vimentin、N-cadherin的mRNA含量顯著高于病變組和息肉組(P<0.05)。見表2。

2.3 各組中遷移及抑癌基因的mRNA含量比較 病變及息肉組CD44v6、MMP9、Caspase-1、Beclin1的mRNA含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；喉癌組CD44v6、MMP-9的mRNA含量顯著高于病變組和息肉組(P<0.05)；喉癌組Caspase-1、Beclin1的mRNA含量均顯著低于病變組和息肉組(P<0.05)。見表3。

表1 各組HPV E7及增殖相關(guān)基因的mRNA含量比較

與喉癌組比較：1)P<0.05；下表同

表2 各組EMT相關(guān)基因的mRNA含量比較

表3 各組中遷移及抑癌基因的mRNA含量比較±s)

3 討 論

HPV是部分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的病原體，高危型HPV mRNA表達(dá)量與喉癌的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。HPV是一種感染人皮膚和黏膜的具有組織特異性的一類噬鱗狀上皮性環(huán)狀DNA病毒。其中E1～6和E7編碼的早期蛋白與DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)，參與DNA的翻譯調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。p53和pRb是兩種主要抑癌蛋白，受E6、E7編碼的癌基因蛋白調(diào)節(jié)。根據(jù)HPV的致癌特性，臨床分為高危型和低危型兩種，高危型HPV主要包括HPV-16、18、31、33、35、45、52、58等，與宮頸癌及頭頸癌的發(fā)生均有關(guān)，低危型HPV主要引起增生病變及良性腫瘤等，包括HPV-6、HPV-11〔12〕。HPV感染者和癌前病變并不一定都會(huì)發(fā)展成癌癥。一項(xiàng)由多國家參與的病例對照研究結(jié)果顯示在中歐和拉丁美洲頭頸部腫瘤高發(fā)的兩個(gè)地區(qū)中喉癌、下咽癌和口咽癌等頭頸腫瘤中HPV的感染率在4%左右；來自亞洲的報(bào)道普遍發(fā)現(xiàn)腫瘤中HPV檢出率高〔13，14〕。聲帶息肉通常被認(rèn)為是假性腫瘤，以往認(rèn)為發(fā)聲不當(dāng)是其發(fā)病主要原因，但大量研究〔15，16〕顯示聲帶息肉中存在HPV感染。目前已經(jīng)證實(shí)女性泌尿生殖系腫瘤與HPV的致癌性有著重要關(guān)系，不僅如此，頭頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生也與HPV感染存在一定的相關(guān)性，也是其一種致病因子〔17〕。HPV病毒基因組分區(qū)的方式很多，其基因結(jié)構(gòu)可劃分為三個(gè)部分，分別為早期區(qū)和晚期區(qū)及長控制區(qū)。主要病毒的細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞的調(diào)控均與早期區(qū)編碼的蛋白有關(guān)。一定的刺激因素是細(xì)胞生長所需，其中長控制區(qū)發(fā)揮重要作用，其編碼的蛋白能夠分別與抑癌基因及其蛋白產(chǎn)物結(jié)合并抑制，兩者被認(rèn)為是兩種癌基因，均具有癌基因生物學(xué)的特點(diǎn)。晚期區(qū)主要編碼的是衣殼，含有主要及次要兩種衣殼蛋白，可負(fù)責(zé)復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。核酸雜交結(jié)果表明，HPV陽性的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中有病毒基因的整合。HPV早期基因組編碼的腫瘤蛋白可以惡性轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的細(xì)胞，移植此轉(zhuǎn)化細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，在較短時(shí)間內(nèi)即可以誘發(fā)惡性腫瘤，證明HPV具有致癌性。

SRSF1、STMN1、MACC1、Survivin是與喉癌組織中細(xì)胞增殖密切相關(guān)性的基因〔18,19〕。SRSF1是SR蛋白家族的主要成員，其參與細(xì)胞周期的調(diào)控，能夠加速細(xì)胞周期的進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞增殖；Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，能夠使細(xì)胞免受凋亡刺激因子的作用并處于持續(xù)增殖狀態(tài)。STMN1、Survivin是兩種促增殖基因，STMN1表達(dá)的產(chǎn)物能夠促進(jìn)有絲分裂過程中紡錘體的形成、進(jìn)而加速細(xì)胞增殖，Survivin表達(dá)的產(chǎn)物能夠拮抗凋亡因素對細(xì)胞的影響、抑制細(xì)胞的凋亡過程。兔肝細(xì)胞生長因子(HGF)能夠促進(jìn)MACC1移位進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)c-Met的表達(dá)，高表達(dá)的c-Met能夠增強(qiáng)HGF的效應(yīng)并增加MACC1的表達(dá)和移位，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。本文提示SRSF1、STMN1、MACC1、Survivin的高表達(dá)與喉癌的發(fā)生有關(guān)。喉癌細(xì)胞在無限增殖的基礎(chǔ)上還表現(xiàn)出浸潤性生長的特征，癌細(xì)胞向周圍組織的浸潤與細(xì)胞的侵襲特性有關(guān)。EMT是使細(xì)胞獲得動(dòng)能和侵襲特性的重要過程，在發(fā)生EMT的過程中，上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞并獲得較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力〔20〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β是影響EMT過程的上游調(diào)節(jié)分子，通過核因子(NF)-κB和Par-4來增加間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin的表達(dá)〔11,12〕；同時(shí)E-cadherin、β-catenin的表達(dá)量降低，細(xì)胞間極性減弱并獲得較強(qiáng)的動(dòng)能，更加容易向局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本文說明上皮標(biāo)志分子表達(dá)減少、間質(zhì)標(biāo)志分子表達(dá)增多與喉癌的發(fā)生有關(guān)。

CD44v6是CD44最重要的變異體，屬于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，所編碼的蛋白能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分相互結(jié)合，進(jìn)而通過多種跨膜信號(hào)傳遞途徑來促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移〔14〕；MMP-9是MMPs家族的重要成員，對細(xì)胞外基質(zhì)以及基底膜中的多種成分具有水解作用，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分的丟失為腫瘤細(xì)胞的遷移創(chuàng)造了有利條件〔15,21,22〕。Beclin1是調(diào)節(jié)自噬過程起始的重要分子，通過PI3K通路形成自噬體并增強(qiáng)自噬活性，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性凋亡；caspase-3是細(xì)胞凋亡程序的執(zhí)行分子，線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑能夠通過不同的通路來激活caspase-3，進(jìn)而由caspase-3來造成細(xì)胞凋亡。本文提示喉癌組織中CD44v6、MMP-9等遷移基因的表達(dá)增加能夠促進(jìn)喉癌細(xì)胞的遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上，HPV mRNA的表達(dá)水平與喉病變的發(fā)展具有緊密關(guān)系，HPV mRNA表達(dá)量異常升高，能夠抑制喉癌細(xì)胞的增殖及EMT相關(guān)基因表達(dá)率隨病變的發(fā)展而增加，表達(dá)水平與喉癌發(fā)展呈正相關(guān)性。檢測HPV E7 mRNA可以為喉癌的預(yù)防，發(fā)展監(jiān)測提供重要的臨床指導(dǎo)。

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〔2015-11-22修回〕

(編輯 苑云杰)

海南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目(No.2014-54)

王海妹(1970-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉-頭頸外科研究。

R739.65

A

1005-9202(2017)08-1859-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.016