王永良 劉忠民 劉眉眉 李 靜 鄭 妍

(吉林大學(xué)體育學(xué)院，吉林 長春 130012)

不同負(fù)荷游泳運(yùn)動對老齡大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)及 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

王永良 劉忠民 劉眉眉1李 靜 鄭 妍2

(吉林大學(xué)體育學(xué)院，吉林 長春 130012)

目的 探討不同負(fù)荷游泳運(yùn)動對老齡大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax及HIF-1蛋白表達(dá)的影響及凋亡機(jī)制。方法 將48只22月齡雄性健康Wistar老齡大鼠隨機(jī)分為對照組(C)、大負(fù)荷組(H)、中等負(fù)荷組(M)和小負(fù)荷組(S)，每組12只，進(jìn)行為期8 w的不同負(fù)荷的游泳運(yùn)動；運(yùn)動干預(yù)后解剖取樣，HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax和HIF-1蛋白表達(dá)。結(jié)果 S組老齡大鼠心肌中Bcl-2表達(dá)與C組(P<0.01)差異非常顯著，H組與C組(P<0.05)差異顯著，S組心肌Bax表達(dá)與C組(P<0.01)差異非常顯著，H組與C組(P<0.05)差異顯著，S組心肌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)與C組(P<0.05)差異顯著，H組與C組(P<0.01)差異非常顯著。適宜的游泳運(yùn)動(S組)心肌纖維排列有序，細(xì)胞間質(zhì)減少，心肌纖維肥厚，走向正常，著色比較均勻，且未觀察到肌絲斷裂，也無充血壞死現(xiàn)象發(fā)生。S組促進(jìn)Bcl-2表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生；大負(fù)荷運(yùn)動或不適宜(H、M組)利于Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，Bax蛋白的表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。結(jié)論 Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)變化是運(yùn)動干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制之一。

游泳運(yùn)動；心肌細(xì)胞形態(tài)；Bcl-2

研究表明〔1〕，長期中等強(qiáng)度的運(yùn)動可造成大鼠心肌細(xì)胞中凋亡調(diào)控基因Bcl-2表達(dá)明顯增加，抑制心肌細(xì)胞凋亡；而力竭運(yùn)動和過度運(yùn)動可引起心肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下降、調(diào)控基因Bax表達(dá)顯著升高以及凋亡調(diào)控基因Bcl-2/Bax比值顯著下降，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡〔2〕?？梢姡\(yùn)動負(fù)荷對心肌細(xì)胞凋亡有一定的影響。本研究擬分析不同運(yùn)動負(fù)荷對心肌細(xì)胞Bcl-2和 Bax表達(dá)的影響。

1 對象與方法

1.1 動物與分組 22月齡自然老化雄性 Wistar大鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2014-0001。48只大鼠體重(561.04±34.53)g；毛色正常，精神狀態(tài)良好，分籠飼養(yǎng)，每籠6只，溫度23℃～25℃，相對濕度50%～60%，自然光照；采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物專用飼料，自由飲水進(jìn)食，間隔1 d更換動物墊料。將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為四組(每組12只)：對照組(C自由飼養(yǎng))、大負(fù)荷組(H)、中等負(fù)荷組(M)和小負(fù)荷組(S)。每周一到周六同一時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，周日休息一天，每周一測一次體重。

1.2 游泳運(yùn)動負(fù)荷的制定 結(jié)合劉忠民等〔3〕的不同負(fù)荷定量標(biāo)準(zhǔn)，制定本實(shí)驗(yàn)不同組的運(yùn)動負(fù)荷，S、M、H組運(yùn)動負(fù)荷分別為15、30、60 min/d。實(shí)驗(yàn)泳池選用高80 cm，直徑為60 cm，水深70 cm的圓形桶中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)整個過程水溫始終保持在(30±2)℃。為保持老齡大鼠的運(yùn)動記憶，每天游泳運(yùn)動安排在統(tǒng)一固定時(shí)間進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物取材與免疫組化染色測試 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻對樣本大鼠進(jìn)行解剖以便進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。首先將5 ml/只鹽酸利多卡因液麻醉大鼠，然后將其固定于手術(shù)臺上，打開胸腔暴露心臟，自左心室插管，迅速剪破右心耳，并快速灌注20 ml 0.9%生理鹽水沖洗，待見清水流出，隨后用4%多聚甲醛溶液緩慢灌注進(jìn)行固定，直到大鼠全身僵硬，尤其尾部僵硬為止。固定后，提取心臟浸泡于甲醛固定液中，以備進(jìn)行免疫組化檢測。按照免疫組化染色試劑的主要操作過程進(jìn)行免疫組化陽性細(xì)胞判定：心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α陽性細(xì)胞呈棕黃色顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 老齡大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu) C組老齡大鼠心肌纖維排列結(jié)構(gòu)紊亂，間隙較寬，間質(zhì)較多，肥大趨勢明顯。經(jīng)歷8 w不同負(fù)荷游泳運(yùn)動后，H組老齡大鼠心肌纖維出現(xiàn)大量斷裂，發(fā)生了不同程度的運(yùn)動性心肌肥大，毛細(xì)血管充血，心肌纖維橫截面出現(xiàn)的空白面積最大，有壞死現(xiàn)象發(fā)生；M 組大鼠心肌纖維斷裂現(xiàn)象明顯，毛細(xì)血管偶見輕度充血，橫斷面空白面積較大，與H 組比較未出現(xiàn)明顯的壞死現(xiàn)象；S組心肌纖維排列有序，細(xì)胞間質(zhì)減少，心肌纖維肥厚，走向正常，著色比較均勻，且未觀察到肌絲斷裂，也無充血壞死現(xiàn)象發(fā)生。見圖1。

2.2 不同負(fù)荷游泳運(yùn)動對大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響 Bcl-2免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞定位在心肌細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒。S 組Bcl-2蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞居最高，H組最低，各組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)S組(0.24±0.05)，M組(0.14±0.03)，H組(0.07±0.04)，C組(0.13±0.02)，S組>M組>C組>H組(P<0.05，P<0.01)，見圖2。

2.3 不同負(fù)荷游泳運(yùn)動對大鼠心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá) Bax免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞定位在心肌細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒。S 組Bax蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞處最低，H組居最高，各組間心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)為S組(0.04±0.02)，M組(0.12±0.02)，H組(0.18±0.02)，C組(0.12±0.04)；H組>C組>M組>S組(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

圖1 心肌細(xì)胞HE染色圖(×200)

圖2 Bcl-2免疫組化樣本陽性細(xì)胞表達(dá)圖(×200，箭頭所指處)

圖3 Bax免疫組化樣本表達(dá)圖(×200，箭頭所指處)

3 討 論

張昊等〔4〕在研究老齡大鼠運(yùn)動訓(xùn)練對心臟影響的研究功能中，老年運(yùn)動組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)觀察可見結(jié)構(gòu)清晰，線粒體數(shù)目增多，基質(zhì)致密，脂褐素顆粒成績顯著減少。余冬敏〔5〕研究力竭游泳應(yīng)激導(dǎo)致大鼠心肌損傷的實(shí)驗(yàn)得出：長期力竭游泳應(yīng)激會使心臟產(chǎn)生一系列病理及功能的改變,造成運(yùn)動性心臟超負(fù)荷,破壞心肌局部組織結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致心肌損傷。郭勇力等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)：中等負(fù)荷組大鼠心肌組織無細(xì)胞壞死現(xiàn)象發(fā)生，心肌結(jié)構(gòu)清晰且排列有序，心肌纖維組織與細(xì)胞核均未見異常，但力竭訓(xùn)練組的大鼠心肌纖維受到不同程度的損傷，心肌組織橫紋呈現(xiàn)模糊或有的消失不見，細(xì)胞核出現(xiàn)破裂或溶解現(xiàn)象，且周邊區(qū)伴有充血狀。綜合以上學(xué)者研究結(jié)果，雖然不同運(yùn)動負(fù)荷及運(yùn)動時(shí)間不一，但適宜的運(yùn)動負(fù)荷運(yùn)動對大鼠心臟最有利的觀點(diǎn)并不相悖。

王艷艷等〔7〕研究藏紅花酸預(yù)處理對心肌缺血大鼠的心肌細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)可能與Bcl-2蛋白表達(dá)增多，Bax蛋白表達(dá)下降有關(guān)。李文娟〔8〕在抗阻練習(xí)對大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡影響的研究中顯示，大鼠進(jìn)行10 w抗組訓(xùn)練后促使D-半乳糖模型SD大鼠腓腸肌Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)明顯減少;潘月順等〔9〕研究結(jié)果顯示：低強(qiáng)度運(yùn)動負(fù)荷可促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，而中等強(qiáng)度運(yùn)動負(fù)荷抑制Bax蛋白表達(dá)量，同時(shí)提高Bcl-2蛋白表達(dá)量，進(jìn)而降低CHF大鼠心肌細(xì)胞的凋亡率；而高強(qiáng)度運(yùn)動負(fù)荷心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)量顯著提高，進(jìn)而使CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高;陳淦等〔10〕研究表明：安靜對照組、中等和大強(qiáng)度運(yùn)動組均有Bcl-2表達(dá)，中等強(qiáng)度運(yùn)動組和安靜對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),大強(qiáng)度運(yùn)動組和安靜對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),大強(qiáng)度運(yùn)動組表達(dá)顯著低于中等強(qiáng)度運(yùn)動組(P<0.05)。適宜運(yùn)動可抑制心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Bcl-2表達(dá)升高，優(yōu)化Bcl-2/Bax比值，有效控制凋亡現(xiàn)象發(fā)生，保證心肌細(xì)胞生存能力，達(dá)到延緩心肌細(xì)胞衰老的效果。大量研究均證明：超負(fù)荷或力竭性運(yùn)動都可加速心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生〔11〕,不適宜的運(yùn)動負(fù)荷會造成大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加,并且可能參與心肌的損害過程。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，適宜的游泳運(yùn)動促進(jìn)Bcl-2表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生；大負(fù)荷運(yùn)動利于Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白的表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。提示Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)變化是運(yùn)動干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制之一，與上述觀點(diǎn)并不相悖。

1 Oltvai ZH，Milliman CL,Korsmeyer SJ,etal.BCL-2 hetero dimerizs in vivo with a conserved homolog Bax，that accelerates program med cell death〔J〕.Cell，1993;74(4):609-19.

2 李明學(xué),程珂玲.有氧運(yùn)動對衰老模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009;29(4):950-2.

3 劉忠民，劉慧佳，宋 燕，等.不同運(yùn)動負(fù)荷對大鼠海馬神經(jīng)c-fos表達(dá)的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011;15(6)：963-4.

4 張 昊，王偉偉，薛 過，等.運(yùn)動訓(xùn)練通過誘導(dǎo)自噬、抑制凋亡改善老齡大鼠心臟功能〔J〕.中國病理生理雜志，2014;30(1)：11-7.

5 余冬敏.力竭游泳應(yīng)激致大鼠心肌損傷的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)碩士論文，2014(2):38-9.

6 郭勇力，劉 霞，張文鋒，等.不同強(qiáng)度運(yùn)動對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國臨床康復(fù)，2004;8(9):1732-3.

7 王艷艷，孫經(jīng)武，樊維娜，等.藏紅花酸預(yù)處理對心肌缺血大鼠凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax表達(dá)影響〔J〕.臨床心血管病雜志，2015;3(1)：93-6.

8 李文娟.抗阻練習(xí)對衰老大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響〔D〕.上海：華東師范大學(xué)碩士論文，2008.

9 潘月順，仇 琪.不同負(fù)荷運(yùn)動對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2014;32(12):1082-7.

10 陳 淦,湯長發(fā).不同強(qiáng)度運(yùn)動對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.生命科學(xué)研究,2012;16(2)：102-7.

11 張鶴亭.不同負(fù)荷運(yùn)動對大鼠心肌細(xì)胞凋亡和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響〔D〕.武漢：武漢體育學(xué)院，2008.

〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201215037)；吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(No.2013C011)；吉林市科技局專項(xiàng)研究項(xiàng)目(No.2015313013)

劉忠民(1960-)，男，教授，主要從事運(yùn)動與健康科學(xué)研究。

王永良(1988-)，男，碩士，主要從事運(yùn)動人體科學(xué)研究。

G804

A

1005-9202(2017)08-1857-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.015

1 長春公安醫(yī)院 2 日本早稻田大學(xué)體育科學(xué)研究科