王 玉 呂艷欣 劉 軍 夏春輝 孫東升 謝立平

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

自噬介導(dǎo)FAS/AD抑制Bel-7402細(xì)胞的增殖

王 玉 呂艷欣 劉 軍1夏春輝 孫東升 謝立平

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

目的 探討在FAS/AD抑制Bel-7402細(xì)胞增殖過程中自噬的作用。方法 通過MTT法檢測3-甲基腺嘌呤(3-MA)對細(xì)胞增殖的影響,通過免疫熒光法檢測LC3及Beclin 1的表達(dá)變化，通過Western印跡檢測Atg12-5和Atg7的表達(dá)，以揭示FAS/AD對Bel-7402細(xì)胞的自噬作用。結(jié)果 與對照組相比,FAS/AD組的細(xì)胞的自噬現(xiàn)象明顯,LC3及Beclin 1高表達(dá)，同時Atg12-5和Atg7也高表達(dá)，而FAS/AD/MA組的活力明顯降低，自噬現(xiàn)象較弱，同時LC3、Beclin 1及Atg12-5和Atg7的表達(dá)降低。結(jié)論 3-MA能明顯減弱FAS/AD誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬作用，且自噬介導(dǎo)FAS/AD抑制BEL-7402細(xì)胞增殖。

FAS抗體;放線菌素D;自噬;凋亡

通常細(xì)胞內(nèi)自噬維持在很低的水平,但是在應(yīng)激條件下被誘導(dǎo),它在細(xì)胞內(nèi)起著各種各樣的功能〔1〕。研究發(fā)現(xiàn),在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的改變。在肝癌、胰腺癌以及乳腺癌中,腫瘤細(xì)胞的自噬活性比其來源的正常細(xì)胞的自噬活性要低,自噬具有維持基因組的穩(wěn)定性的功能從而抑制腫瘤的發(fā)生〔2,3〕。凋亡是抑制腫瘤發(fā)生的一個重要機(jī)制,在腫瘤細(xì)胞中,自噬在某些情況下能夠增加細(xì)胞的凋亡〔4〕。雖然現(xiàn)在許多證據(jù)表明自噬具有腫瘤抑制的功能,但是不可否認(rèn),自噬可以促進(jìn)腫瘤的存活，可能是由于自噬具有細(xì)胞保護(hù)作用和營養(yǎng)的回收再利用的功能〔5〕。在營養(yǎng)缺乏的條件下,抑制自噬可以誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞的凋亡。因此,自噬在腫瘤的發(fā)生過程中起著雙重的作用,它在腫瘤發(fā)生過程中的具體機(jī)制還需要更加進(jìn)一步的研究。本課題組研究發(fā)現(xiàn)FAS/AD通過誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖，同時出現(xiàn)了細(xì)胞自噬的現(xiàn)象，自噬是促進(jìn)細(xì)胞增殖還是抑制細(xì)胞增殖，這是我們所感興趣的，因此我們利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)的作用通過自噬的標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin 1〔6〕及自噬相關(guān)蛋白Atg〔7〕的變化研究自噬與細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 MTT和胰酶購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；FAS抗體購自Cell Signaling Technology公司；LC3、Beclin 1及Atg5,7,12抗體和二抗購自Santa cruz公司；Actinomycin D(AD)購自CalBio-chem；Bel-7402細(xì)胞購自中科院動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入青霉素100 U/L、鏈霉素100 mg/L，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分成:對照組;FAS/AD組;FAS/AD/MA組。換液2 h后進(jìn)行處理，F(xiàn)AS/AD組：在Bel-7402細(xì)胞中添加FAS抗體(6 μmol/L) 和 AD(20 μmol/L)。FAS/AD/MA組：在Bel-7402細(xì)胞中添加FAS抗體(6 μmol/L)、AD(20 μmol/L)和3-MA(5 mmol/L)。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞的生長情況 取對數(shù)生長期的Bel-7402細(xì)胞用胰酶消化后接種于96孔板，每孔為1×104個細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h細(xì)胞完全貼壁后換液，2 h后加藥，每個濃度設(shè)三個平行孔，培養(yǎng)6,12,24 h后加5 g/L MTT 20 μl，再培養(yǎng)4 h后每孔加150 μl DMSO，10 min后待藍(lán)紫色結(jié)晶物質(zhì)溶解后酶標(biāo)儀檢測，波長為雙波長570 nm和630 nm。細(xì)胞活力=(實驗組A/對照組A)×100%〔8〕。當(dāng)細(xì)胞活力<30%為高度敏感，30%≤細(xì)胞活力<50%為中度敏感，50%≤細(xì)胞活力≤70%為低度敏感，細(xì)胞活力>70%為不敏感。

1.2.3 Western印跡方法檢測蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞藥物作用24 h后收集細(xì)胞,提取總蛋白檢測LC3及Beclin 1。 用Lowry法測定含量蛋白經(jīng) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上,用含 50 g/L奶粉的TBST室溫封閉1 h;分別加一抗(1∶1 000稀釋),在4℃冰箱過夜;用TBST漂洗 10 min×3次;加1∶5 000稀釋的過氧化物酶結(jié)合的二抗,室溫孵育1 h;用TBS漂洗10 min×2次,TBST漂洗10 min×1次,ECL發(fā)光 。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 3-MA對細(xì)胞活力的影響 將不同濃度的3-MA作用于Bel-7402細(xì)胞24 h，通過MTT實驗，根據(jù)酶標(biāo)儀的吸光度值對細(xì)胞活力進(jìn)行評價，7.5 μmol/L(78.63%±1.37%)和10 μmol/L(49.97%±1.57%)對細(xì)胞活力影響最大，差異明顯。當(dāng)3-MA 的濃度為7.5 μmol/L時P=1.13×10-5,當(dāng)3-MA 的濃度為10 μmol/L時P=6.49×10-7，而0 μmol/L(100%)、2 μmol/L(99.12%±0.61%)、5 μmol/L(98.93%±0.71%)的3-MA對細(xì)胞活力無影響(P>0.05)，因而選定5 μmol/L的3-MA進(jìn)行后續(xù)的實驗。將5 μmol/L的3-MA作用于FAS/AD刺激的Bel-7402細(xì)胞，分別作用6 h、12 h、24 h、48 h，3-MA作用24 h時FAS/AD刺激下Bel-7402細(xì)胞活力下降明顯(P=0.000 1)。見表1。

表1 3-MA對FAS/AD作用下的Bel-7402 細(xì)胞活力的影響

與FAS/AD組比較：1)P<0.01

2.2 FAS/AD誘導(dǎo)LC3及Beclin 1的表達(dá) 在對照組LC3幾乎檢測不到，Beclin 1有微弱的表達(dá)，當(dāng)FAS/AD作用后LC3(紅)與Beclin 1(綠)都有表達(dá)且很明顯，說明自噬已經(jīng)發(fā)生，當(dāng)添加了3-MA后，這種自噬現(xiàn)象反倒減弱了，說明3-MA能降低FAS/AD引起的細(xì)胞自噬現(xiàn)象，見圖1。

2.3 FAS/AD影響Atg12-5、Atg7的表達(dá) 從圖2中可以看到對照組Atg12-5的表達(dá)很低，而FAS/AD組表達(dá)很高，二者差異顯著，而3-MA作用后能明顯降低Atg12-5的表達(dá)。同樣Atg7在對照組表達(dá)非常低，而在FAS/AD組強表達(dá)，在FAS/AD/MA組表達(dá)降低，根據(jù)以上結(jié)果得出FAS/AD能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬作用，且能被自噬抑制劑3-MA減弱。

1:對照組；2:FAS/AD組；3:FAS/AD/MA組；A:LC3表達(dá)(紅色)；B:Beclin 1表達(dá)(綠色)；C:LC3與Beclin 1共表達(dá)(黃色)圖1 LC3與Beclin 1在Bel-7402細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

1～3：對照組、FAS/AD組、FAS/AD/MA組圖2 各組Atg12-5、Atg7的表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞的死亡形式分為凋亡性程序性細(xì)胞死亡、自噬性程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞壞死三種類型〔9〕。程序性死亡(PCD)對于腫瘤細(xì)胞的惡性增殖至關(guān)重要。傳統(tǒng)的腫瘤治療方案主要以凋亡為靶標(biāo)，但是腫瘤發(fā)生過程中凋亡受抑已經(jīng)是被廣泛認(rèn)知的重要事件。清除癌細(xì)胞不能僅僅通過凋亡性死亡，還可以通過其他死亡方式比如自噬性死亡來實現(xiàn)，自噬可抑制癌細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡〔10〕。

本課題已證明FAS/AD是通過誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖的〔11〕，同時伴有自噬現(xiàn)象,當(dāng)自噬特異性抑制劑3-MA作用后，F(xiàn)AS/AD抑制增殖的作用反而增強了，說明自噬介導(dǎo)FAS/AD對細(xì)胞增殖的抑制作用。因而我們應(yīng)用自噬的特異性的自噬抑制劑3-MA來進(jìn)一步探討自噬在FAS/AD抑制Bel-7402細(xì)胞增殖中的作用。3-MA通過抑制m型PI3K的活性起作用，并且可以干擾微管相關(guān)蛋白LC3定位于自噬體膜，從而干擾自噬體的形成，因此本文清楚地觀察到FAS/AD誘導(dǎo)LC3和Beclin 1的表達(dá)，但這種表達(dá)可被3-MA部分抑制。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成，現(xiàn)已作為自噬體的特異性標(biāo)記蛋白〔12〕。自噬相關(guān)基因Beclin 1基因也稱BECNI基因是哺乳動物參與自噬的特異性基因，作為調(diào)節(jié)自噬的重要因子之一，Beclin 1的表達(dá)水平一定程度上反映了自噬的活性〔13〕。LC3與Beclin 1作為自噬的標(biāo)志蛋白，他們的檢測是細(xì)胞發(fā)生自噬的有力證據(jù)。

細(xì)胞自噬的整個過程被進(jìn)化上高度保守的一系列自噬相關(guān)基因Atg所控制。在哺乳動物的自噬泡形成過程中，由Atg12-5和LC3參與組成的兩條泛素樣蛋白加工修飾過程，對自噬復(fù)合體的形成具有關(guān)鍵作用,Atg12-5結(jié)合過程與前自噬泡的形成相關(guān)〔7〕。Atg7是 Atg12-5和 LC3 兩條泛素樣蛋白通路位置上游的蛋白質(zhì)分子，是自噬過程的必須蛋白分子，阻斷后可以顯著減少自噬性細(xì)胞死亡的發(fā)生。本文顯示，F(xiàn)AS/AD促進(jìn)Atg12-5的高表達(dá)，同時Atg7也表達(dá)，但是3-MA作用后Atg12-5與Atg7的表達(dá)都降低，F(xiàn)AS/AD誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬作用可被3-MA減弱。

1 Hale AN,Ledbetter DJ,Gawriluk TR,etal.Autophagy regulation and role in development〔J〕.Autophagy,2013;9(7):951-72.

2 Kaser A，Blumberg RS.Autophagy，microbial sensing，endoplasmic reticulum stress，and epithelial function in inflammatory bowel disease〔J〕.Gastroenterology,2011;140(6):1738-47.

3 Hidvegi T,Ewing M,Hale P,etal.An autophagy-enhancing drug promotes degradation of mutant alpha1-antitrypsin Z and reduces hepatic fibrosis〔J〕.Science,2010;329(5988):229-32.

4 Hansen TE,Johansen T.Following autophagy step by step〔J〕.BMC Biol,2011;9(1):39.

5 Glick D,Barth S,Macleod KF.Autophagy:cellular and molecular mechanisms〔J〕.J Pathol,2010;221(1):3-12.

6 郭 鑫,楊 俊.Beclin1 調(diào)控自噬、凋亡與炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014;34(18):5289-91.

7 Romanov J,Walczak M,Ibiricu I,etal.Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5-Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation〔J〕.EMBO J,2012;31(22):4304-17.

8 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays〔J〕.J Immunol Methods,1983;65(1):55-63.

9 Mizushima N,Levine B,Cuervo AM,etal.Autophagy fights disease through cellular self-digestion〔J〕.Nature,2008;451(7182):1069-75.

10 Herman-Antosiewicz A,Johnson DE,Singh SV.Sulforaphane causes autophagy to inhibit release of cytochrome C and apoptosis in human prostate cancer cells〔J〕.Cancer Res,2006;66(11):5828-35.

11 Wang Y,Sun LG,Xia CH,etal.P38MAPK regulates caspase-3 by binding to caspase-3 in nucleus of human hepatoma Bel-7402 cells during anti-Fas antibody-and actinomycin D-induced apoptosis〔J〕.Biomed Pharmacother，2009;63(5):340-50.

12 Johansen T,Lamark T.Selective autophagy mediated by autophagic adapter proteins〔J〕.Autophagy,2011;7(3):279-96.

13 付 俊,尚海旭,賈弘禔,等.Beclin1 與自噬及腫瘤的關(guān)系〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展,2012;43(2):155-8.

〔2015-12-13修回〕

(編輯 曹夢園)

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No.12521616)

夏春輝(1969-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事光敏劑對腫瘤細(xì)胞的影響研究。

王 玉(1970-)，女，博士，主要從事腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。

R854

A

1005-9202(2017)08-1847-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.011

1 齊齊哈爾大學(xué)