張瓊宇 李 培 葵 旭 胡曉軍 孫遠(yuǎn)東

(永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南 永州 425100)

Hep2-exo負(fù)載樹突細(xì)胞誘導(dǎo)抗喉癌免疫效應(yīng)的機(jī)制

張瓊宇 李 培 葵 旭 胡曉軍 孫遠(yuǎn)東1

(永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南 永州 425100)

目的 探討人喉癌細(xì)胞Hep2細(xì)胞來(lái)源外泌體(Hep2-exo)負(fù)載樹突細(xì)胞(DC)后體外刺激細(xì)胞毒T細(xì)胞對(duì)Hep2細(xì)胞的殺傷作用。方法 利用蔗糖密度梯度超速離心法從Hep2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離Hep2-exo。透射電子顯微鏡鑒定Hep2-exo形態(tài)，Western印跡分析Hep2-exo表面CD9分子表達(dá)。分離培養(yǎng)喉癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的DC，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表型。用MTT法檢測(cè)負(fù)載Hep2-exo的DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞毒T細(xì)胞對(duì)Hep2細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果 透射電鏡下見Hep2-exo呈典型的杯狀,大小相對(duì)均一，平均直徑30～100 nm。Hep2-exo表面有CD9CD63分子表達(dá)。單個(gè)核細(xì)胞DC有CD1a分子表達(dá)說(shuō)明誘導(dǎo)成功，邊緣有絨毛樣突起，呈典型的PC形態(tài)。負(fù)載Hep2-exo的DC刺激T細(xì)胞增殖能力及T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯強(qiáng)于未負(fù)載Hep2-exo的DC(P<0.05)。結(jié)論 負(fù)載Hep2-exo的DC 能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，可體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答抑制喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

喉癌；外泌體；Hep2細(xì)胞裂解物；樹突細(xì)胞；T細(xì)胞

外泌體是一種小型的細(xì)胞膜包裹的結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的納米級(jí)小囊泡，為脂質(zhì)雙層膜包裹的扁平球體，呈杯狀，直徑約在30～100 nm。多種類型細(xì)胞均能以這種胞外分泌的方式釋放外泌體(Exo)〔1〕。腫瘤細(xì)胞來(lái)源外泌體(Texo)富含主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子、腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、共刺激分子等分子，能夠誘導(dǎo)抗腫瘤相關(guān)的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞(CTL)應(yīng)答反應(yīng)〔2〕，但是效率較低，難以達(dá)到治療和預(yù)防腫瘤的效果。所以，增強(qiáng)Texo誘導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)是開發(fā)以Texo為基礎(chǔ)的高效腫瘤疫苗的關(guān)鍵。來(lái)源于抗原提呈細(xì)胞(APC)的Exo能夠有效刺激 T淋巴細(xì)胞的體外增殖，并且可以誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。包含腫瘤抗原的Texo可以通過(guò) APC 交叉呈遞給CTL，使其產(chǎn)生腫瘤殺傷CTL反應(yīng)。研究顯示，Texo能夠在體內(nèi)靶向結(jié)合樹突細(xì)胞(DC)，靶向結(jié)合的DC可誘導(dǎo)較腫瘤裂解物負(fù)載DC更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)〔3〕。從人喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞分離Hep2-exo，體外與DC共同培養(yǎng)，使之負(fù)載。本文主要探討Hep2-exo負(fù)載DC后誘導(dǎo)CTL，從而對(duì)Hep2細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)細(xì)胞 Hep2購(gòu)自中科院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。新鮮喉癌患者全血由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院提供。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于北京鼎國(guó)生物科技有限公司；重組人白細(xì)胞介素(rhIL)-4、重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α細(xì)胞因子購(gòu)于派普泰克公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自Sigma公司；人-CD1a-APC,人-IgG1-APC抗體和人-CD14 磁珠均購(gòu)自德國(guó)美天旎公司；人CD9單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司；

1.3 Hep2-exo的分離 將Hep2細(xì)胞用含 10% 胎牛血清的二甲基亞砜(DMEM)培養(yǎng)液于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液10 ml，3 000 r/min離心15 min，去除細(xì)胞或細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的滅菌管中加入2 ml ExoQuick試劑，上下顛倒離心管混勻。4℃孵育過(guò)夜(12 h)后,1 500 r/min離心30 min，管底可見米白色沉淀，去除上清后，1 500 r/min繼續(xù)離心5 min，小心再次去除上清。取適量磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白含量，后用0.22 μm濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后進(jìn)行分裝，進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。

1.4 利用透射電鏡研究Hep2-exo 形態(tài)特征 將獲得樣品用超速離心機(jī)10 000 r/min離心10 min，棄掉上清，用2.5%戊二醛固定。經(jīng)過(guò)PBS漂洗；1%四氧化鋨(OsO4)固定；PBS漂洗，酒精丙酮梯度脫水，浸透，包埋聚合，然后制備70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，JEM-1200EX(日本JEOL公司)鏡下觀察，拍片。

1.5 Western印跡分析CD9分子表達(dá) 首先進(jìn)行Hep2細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后取1×108/ml個(gè)Hep2細(xì)胞，液氮反復(fù)快速凍融4次，然后1 000 r/min離心30 min，所獲得的上清液即為細(xì)胞裂解物抗原，通過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白定量。按40 μg蛋白上樣量，取Hep2-exo及Hep2細(xì)胞裂解物，將樣品加入上樣緩沖液進(jìn)行煮沸變性，12%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，在室溫下經(jīng)過(guò)5% 脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗(1∶1 000)4℃ 過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光液(美國(guó)賽默飛公司)曝光顯影。

1.6 單核細(xì)胞來(lái)源DC的誘導(dǎo)培養(yǎng) 取喉癌患者新鮮抗凝人外周血加入PBS，混勻后在離心管底部加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，首先300 r/min離心30 min，收集乳白色細(xì)胞層，適量PBS洗滌后，300 r/min離心25 min，收集細(xì)胞。PBS重復(fù)洗滌，計(jì)數(shù)后備用，此為外周血單個(gè)核細(xì)胞。利用CD14細(xì)胞磁珠分選系統(tǒng)分離CD14+細(xì)胞，然后進(jìn)行凍存同一樣本的CD14-細(xì)胞。將收集的CD14+細(xì)胞用進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。加入細(xì)胞因子rhGM-CSF 1 000 IU/ml，rhIL-4 1 000 IU/ml，TNF-α 1 000 IU/ml。將CD14+細(xì)胞(1×106/ml/孔)接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)的第3天補(bǔ)加相同濃度細(xì)胞因子，第7天時(shí)，取其中一個(gè)孔中1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)CD1a，鑒定細(xì)胞為DCs。其中另兩孔用Hep2-exo(10 μg)負(fù)載DC培養(yǎng)48 h，使之成為Hep2-exo-DC。

1.7 T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將對(duì)應(yīng)同一個(gè)體CD14-細(xì)胞復(fù)蘇，并且用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入尼龍毛柱中。經(jīng)過(guò)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng) 1 h后，收集 T 淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)并進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組，將DC與T淋巴細(xì)胞(T)按1∶3(105/孔∶3×105/孔)比例混合培養(yǎng)，A組：Hep2-exo-DC + T；B組：DC+T；C組：T。96 孔培養(yǎng)板(100 μl/孔)中接種各組細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)72 h每孔加入20 μl噻唑藍(lán)(MTT)，孵育4 h后，每孔再加入150 μl DMSO，混勻后，通過(guò)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Varioskan Flash)于波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光度值。

1.8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 設(shè)實(shí)驗(yàn)組、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組、Hep2靶細(xì)胞對(duì)照組、DC對(duì)照組和陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為Hep2-exo-DC + T (比例為1∶3)，T淋巴細(xì)胞為效應(yīng)T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組按效靶比12.5∶1，25∶1，50∶1，加入已鋪好靶細(xì)胞的Hep2細(xì)胞(1×104/孔)的96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。所有孔在IL-2(400 U/ml)條件下，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMEM 150 μl，于波長(zhǎng)490 nm測(cè)定A值，計(jì)算殺傷活性：CTL殺傷活性(%)=〔靶細(xì)胞對(duì)照組A值-(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組A值)〕/靶細(xì)胞對(duì)照組A值× 100%。

2 結(jié) 果

2.1 Hep2-exo的鑒定結(jié)果 Hep2細(xì)胞分泌的Exo呈圓形或橢圓形，大小相對(duì)均一，其外可見有脂質(zhì)膜包裹，內(nèi)部為低電子密度物質(zhì)，平均直徑30～100 nm，同國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道〔1,2〕一致。Hep2細(xì)胞裂解物和Hep2-exo均表達(dá)CD9和CD63分子，Hep2-exo表達(dá)CD9和CD63灰度值比Hep2細(xì)胞裂解物高。見圖1，圖2。

2.2 DC表型分析 來(lái)源于PBMC的CD14+經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子(rhGM-CSF,rhIL-4,TNF-α)誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7天，顯微鏡見大部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，出現(xiàn)毛刺樣突起，呈現(xiàn)典型的樹枝狀突樣。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析顯示DCs表面高表達(dá)CD1a分子，則證明DC誘導(dǎo)成功。見圖3。

圖1 Hep2細(xì)胞來(lái)源Exo電鏡圖(×20 000)

圖2 Western印跡結(jié)果分析

圖3 DC的形態(tài)與表型鑒定

2.3 Hep2-exo負(fù)載DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖 相比僅有T細(xì)胞的對(duì)照組(0.26±0.14)，Hep2-DC + T組(1.76±0.17)和DC+T組(7.20±0.17)的T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。此結(jié)果說(shuō)明負(fù)載Hep2-exo的DC和未負(fù)載Hep2-exo的DC具有刺激T 細(xì)胞活化增殖能力。而且Hep-exo-DC + T組同DC + T 組相比，Hep-exo-DC + T組具有更強(qiáng)的增殖能力，說(shuō)明負(fù)載Hep2-exo的 DC 與未負(fù)載 Hep2-exo的DC相比，刺激 T 細(xì)胞活化的能力更強(qiáng)(P<0.05)。

2.4 Hep2-exo致敏DC誘導(dǎo)CTL的特異性殺傷作用 負(fù)載Hep2-exo的 DC 在效靶比為12.5∶1時(shí)，其抗Hep2細(xì)胞能力與未負(fù)載Hep2-exo的 DC、Hep2-exo、 T 細(xì)胞對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是在效靶比25∶1，50∶1時(shí)，負(fù)載Hep2-exo的DC 誘導(dǎo) CTL 抗Hep2細(xì)胞能力明顯高于其他三組。在效靶比50∶1時(shí)，抗Hep2細(xì)胞活力能力最高。見圖4。

圖4 Hep2-exo負(fù)載 DC 誘導(dǎo)特異性CTL活性

3 討 論

作為生長(zhǎng)在人頭頸部的惡性腫瘤，根據(jù)我國(guó)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，喉癌發(fā)病率占全身惡性腫瘤的1%～2%，然而其占耳鼻喉科惡性腫瘤的發(fā)病率達(dá)到了10%～12%，并且出現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)〔4〕。在目前的技術(shù)下，主要以手術(shù)臨床治療喉癌，并且以放療和化療進(jìn)行輔助治療。但是這有許多缺點(diǎn)，由于腫瘤易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，最主要的是放療和化療缺乏針對(duì)性的治療，并且不能明顯提高喉癌患者的生存率和生活質(zhì)量。在國(guó)內(nèi)外，生物免疫治療已經(jīng)成為腫瘤的第四種治療模式，并且已經(jīng)在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。例如利用 DC能夠有效特異性遞呈抗原的生物學(xué)特性，激活初始型T淋巴細(xì)胞，使其活化為抗原特異的CTL誘導(dǎo)患者機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性的持久免疫應(yīng)答。

Texo作為多種活細(xì)胞分泌的囊泡圓形或者橢圓形球體結(jié)構(gòu)，但是其最終發(fā)揮的功能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞來(lái)源的不同而不同〔5～7〕。研究顯示，Texo含有MHC-Ⅰ類分子、熱休克蛋白、腫瘤相關(guān)抗原等〔8,9〕，并且存在腫瘤抗原運(yùn)載系統(tǒng)(HSPs)以及與細(xì)胞靶向性有關(guān)的蛋白(CD9 和 CD63)。說(shuō)明腫瘤Texo也是一種抗原傳遞系統(tǒng)，能夠?qū)⒛[瘤抗原轉(zhuǎn)移到抗原遞呈細(xì)胞，能夠激活T淋巴細(xì)胞增殖和CTL反應(yīng)，但是效率較低，難以達(dá)到治療腫瘤的效果。但是經(jīng)DC攝取后，進(jìn)而進(jìn)行遞呈抗原，因此而激活 T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)，從而能夠表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤免疫效應(yīng)〔10〕。本次研究中采用SBI公司ExoQuick試劑盒從Hep2細(xì)胞上清液提取外泌體，電鏡下見Hep2細(xì)胞分泌的呈圓形或橢圓，大小相對(duì)均一，其外可見有脂質(zhì)膜包裹，內(nèi)部為低電子密度物質(zhì)，平均直徑30～100 nm，表面有CD9CD63分子表達(dá)，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致〔11〕。喉癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子成功誘導(dǎo)成DCs后，然后用Hep2-exo進(jìn)行體外刺激，研究負(fù)載Hep2-exo的DC激活T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)并且激活對(duì)喉癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。本研究結(jié)果Hep2-exo致敏DC能夠有效誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化增殖，CTL 被激活以后抑制Hep2細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。雖然Hep2-exo能夠繼承腫瘤細(xì)胞中的 MHC-Ⅰ類分子和腫瘤抗原，然而并不能有效激活誘導(dǎo) CTL 反應(yīng)，雖然目前研究用腫瘤抗原刺激DC后的外泌體誘導(dǎo)CTL抗腫瘤，但是因?yàn)槠淇鼓[瘤效率不及DC〔12〕。因此選擇利用Texo負(fù)載DC，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。因此通過(guò)研究結(jié)果推測(cè)，首先，T 淋巴細(xì)胞的活化增殖需要腫瘤抗原、MHC 分子的刺激，第二還需要 DC 等抗原提呈細(xì)胞提供共刺激信號(hào)。當(dāng)這兩項(xiàng)條件滿足時(shí)，Hep2-exo負(fù)載到DC上時(shí)，才能高效誘導(dǎo) CTL 反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究利用最新的試劑盒方法成功地從分離了Hep2-exo，更有臨床意義的是證實(shí)了Hep2-exo負(fù)載DC可誘導(dǎo) CTL反應(yīng)，引起有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)，從而為喉癌的生物免疫治療提供臨床治療的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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〔2016-12-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

永州市2015年度第二批指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目(永科發(fā)〔2015〕10號(hào))

孫遠(yuǎn)東(1975-)，男，博士，副教授，主要從事細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域研究。

張瓊宇(1982-)，男，博士，講師，主要從事發(fā)育生物學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2017)08-1827-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.003

1 湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院