徐 虎 包樂群 呂勝啟

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

miR-301a促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制

徐 虎 包樂群1呂勝啟2

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

目的 探討miR-301a對(duì)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及分子機(jī)制。方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)40例結(jié)腸癌患者癌組織中miR-301a的表達(dá)水平，探究結(jié)腸癌和miR-301a表達(dá)的關(guān)系。同時(shí)在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞過表達(dá)和干擾miR-301a，MTT法檢測(cè)miR-301a對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響。蛋白免疫技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR在分子水平上檢測(cè)miR-301a表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞中侵襲相關(guān)分子的表達(dá)水平，探究miR-301a調(diào)控下的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β/Smad4/基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示40例結(jié)腸癌患者癌組織中miR-301a的表達(dá)水平明顯升高，且隨著腫瘤分期分級(jí)的升高，其水平明顯升高。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-301a的HT29細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而干擾miR-301a則細(xì)胞數(shù)目減少，表明miR-301a可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。在分子水平上蛋白免疫技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-301a通過下調(diào)TGF-β和Smad-4的表達(dá)，促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，最終促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)論 miR-301a通過下調(diào)TGF-β/Smad4信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，最終促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

miR-301a；結(jié)腸癌；基質(zhì)金屬蛋白-9；侵襲；轉(zhuǎn)移

目前結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年攀升，預(yù)后和5年生存率主要取決于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與否。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β作為分泌蛋白，介導(dǎo)絲氨酸/蘇氨酸激酶受體后的信號(hào)通路〔1，2〕，參與TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)控〔3〕。TGF-β/Smad信號(hào)通路已被證明參與多種癌癥的致癌作用，如誘導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及上皮細(xì)胞的間質(zhì)化〔4〕。miR-301a作為原癌基因，其表達(dá)失調(diào)可影響到眾多腫瘤的發(fā)生，目前miR-301a在不同腫瘤中的表達(dá)和作用尚存在爭(zhēng)議〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-301a通過下調(diào)Smad4的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生。miR-301a通過調(diào)節(jié)AR/TGF-β1/Smad/基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移〔6〕。此外，miR-301a是阿霉素耐藥性骨肉瘤的潛在生物標(biāo)志物，借助調(diào)控miR-301a的表達(dá)改善骨肉瘤的阿霉素耐藥性〔7〕。miR-301a的高表達(dá)通常與三陰性乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)〔8〕。但是對(duì)于miR-301a在結(jié)腸癌中的表達(dá)及作用目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道，本研究旨在探討miR-301a在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)和細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)，微量移液器(Eppendorf公司)，PCR儀(Bio-Rad公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)ABI7500(Applied Biosystems公司)。

1.2 主要試劑和材料 胎牛血清(Ausgene公司)，DMEM培養(yǎng)基(Life technology)，Lipo2000 (Invitrogen)，opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco)，RIPA裂解液(碧云天)，Trizol(Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC)水(sigma)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，SYBR green (羅氏)。miRNA-301a前體片段及陰性對(duì)照片段，miRNA-301a anti-sense片段及陰性對(duì)照片段均購自Ambion公司，且經(jīng)上海生工公司測(cè)序鑒定。miR-301a、Smad-4和MMP-9引物使用primer 5.0設(shè)計(jì)并由生工合成，miR-301a正義：5′-CTATGCCCGTATTGACGGCCAT-3′,反義：5′-CGAACGTGGTTCGTACGGGTAA-3′;Smad-4正義：5′-AGGCTTGCATTGCAACGGTTCAC-3′,反義：5′-TGACGTCTTGCACTCGGACCTGCC-3′;MMP-9正義：5′-CCCAAACGTGGTCCGTACCGTC-3′,反義：5′-TCGCCAGTTTGCCCGTACGCG-3′;GAPDH正義：5′-GACCCGATCCTGGAACTGATTAG-3′,反義：5′-GGGACCTTGCTTTGCATCGACC-3′。

1.3 樣本來源 選取2013年9月至2014年12月在武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院普外科室住院的結(jié)腸癌患者40例為實(shí)驗(yàn)組，其中男25例，女15 例，年齡47～72歲。所有入組患者的腫瘤分期和分級(jí)均參照AJCC/UICC頒布的結(jié)直腸癌的腫瘤分期和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)腸癌Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例，Ⅳ期9例，所有患者病情穩(wěn)定，無腫瘤出血、腸穿孔、腸梗阻、急慢性感染等并發(fā)癥。另選取結(jié)腸癌I期患者癌旁手術(shù)組織作為對(duì)照組。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中。同時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT29細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miR-301a前體片段、miR-301a anti-sense片段及陰性對(duì)照片段作為過表達(dá)組、干擾組和對(duì)照組。轉(zhuǎn)染方法按照Life technology公司的Lipo 2000說明書操作。轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HT29細(xì)胞中miR-301a過表達(dá)及干擾情況，同時(shí)提取RNA檢測(cè)相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)量。

1.5 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)miR-301a對(duì)HT29細(xì)胞數(shù)量的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用Tripsin-EDTA消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，100 μl/孔。細(xì)胞貼壁后再培養(yǎng)12 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制5 mg/ml MTT溶液，每孔加20 μl，注意保持避光繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔避光加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)充分融解結(jié)晶物，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處測(cè)量各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)腸癌腫瘤組織以及HT29細(xì)胞的總RNA用Invitrogen公司Trizol提取，具體步驟包括Trizol室溫裂解、氯仿沉降蛋白、異丙醇沉淀RNA，75%酒精(DEPC水配制)洗滌RNA、DEPC水溶解RNA，最后檢測(cè)RNA純度及濃度。按照M-MLV reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)結(jié)腸癌腫瘤組織以及HT29細(xì)胞的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-301a、Smad-4和MMP-9在mRNA水平上的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸癌組織中miR-301a的表達(dá)水平 結(jié)腸癌患者癌組織中miR-301a表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且隨著結(jié)腸癌分級(jí)分期的升高，miR-301a表達(dá)水平亦升高，這表明miR-301a和結(jié)腸癌的發(fā)生具有一定的機(jī)制關(guān)聯(lián)。見圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)腸癌組織中 miR-301a的表達(dá)水平

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HT29細(xì)胞過表達(dá)和干擾MiR-301a表達(dá)效果 對(duì)照組miR-301a表達(dá)為1.16±0.97，miR-301a前體片段可明顯上調(diào)HT29細(xì)胞中miR-301a的表達(dá)水平(3.39±1.04)，同時(shí)miR-301a anti-sense片段通過結(jié)合降解miR-301a，減少HT29細(xì)胞中miR-301a的水平(0.47±0.09)，表明miR-301a前體片段和miR-301a anti-sense片段具有明顯的調(diào)控表達(dá)的效果。

2.3 MTT法檢測(cè)miR-301a對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響 miR-301a過表達(dá)組HT29細(xì)胞數(shù)量(5.07±1.31)明顯多于對(duì)照組(1.15±0.82)，表明miR-301a可能參與促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。同時(shí)干擾miR-301a表達(dá)的HT29細(xì)胞數(shù)量(0.42±0.06)則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，更加明確了miR-301a在HT29細(xì)胞增殖中的作用。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-301a對(duì)侵襲相關(guān)分子表達(dá)水平的影響 對(duì)照組TGF-β、Smad-4、MMP-9 mRNA表達(dá)1.19±0.46，1.12±0.37，1.26±0.52，過表達(dá)miR-301a可下調(diào)TGF-β、Smad-4 mRNA水平(0.48±0.02，0.43±0.02)，同時(shí)上調(diào)MMP-9 mRNA的表達(dá)(4.98±1.06)，這表明miR-301a可能通過下調(diào)TGF-β/ Smad4信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，最終提高細(xì)胞外基質(zhì)的降解速率，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。干預(yù)組TGF-β、Smad-4、MMP-9 mRNA表達(dá)量3.72±1.02，2.51±0.98，0.39±0.01。

3 討 論

miRNAs是一類保守的、短小的非編碼RNA，miRNAs一般全長(zhǎng)約19～22個(gè)核苷酸，其主要通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，即結(jié)合靶基因的信使RNA在翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。此外miRNAs在代謝綜合征，各種腫瘤的發(fā)病中具有誘導(dǎo)作用，尤其是在腫瘤細(xì)胞中，miRNAs可作為癌基因或抑癌基因調(diào)控腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成〔9〕。研究顯示在乳腺癌以及肺癌腫瘤組織中miRNAs作為抑癌基因，其表達(dá)多降低，在結(jié)腸癌以及肝癌組織中有些miRNAs作為原癌基因其表達(dá)多升高〔10〕。如miR-205可作為腦膠質(zhì)瘤的一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)志物，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔11〕；miR-940通過直接調(diào)控ZNF24的表達(dá)促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移〔12〕。miRNAs作為重要的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控者，成為各種細(xì)胞過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子，包括細(xì)胞分化、自我更新、細(xì)胞增殖和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs通過與靶基因的5′非翻譯區(qū)相互作用調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，其可調(diào)節(jié)超過30%的人類基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控〔13〕。miRNAs可調(diào)控許多組織的癌癥進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)p53突變的腫瘤部分是通過調(diào)控miRNAs的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的〔14〕，miR-301a作為癌基因在結(jié)腸癌總的致侵襲和致轉(zhuǎn)移的作用目前還不清楚。通過檢測(cè)人結(jié)腸癌組織中miR-301a的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中miR-301a常高表達(dá)，同時(shí)過表達(dá)miR-301a的HT29細(xì)胞數(shù)目增加，而干擾miR-301a表達(dá)的HT29細(xì)胞則數(shù)目減少。且過表達(dá)miR-301a的HT29細(xì)胞中Smad-4和MMP-9表達(dá)升高，促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。近期有研究發(fā)現(xiàn)，miR-301a可介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中的作用，β-catenin通過與TCF/LEF基因結(jié)合蛋白相互作用，激活含有TCF/LEF元件的miR-301a的表達(dá)〔15〕。有研究表明源于腫瘤的miRNA在血液中可免受核糖核酸酶的降解而穩(wěn)定存在〔16〕。通過本研究發(fā)現(xiàn)，miR-301a通過下調(diào)SMAD4促進(jìn)MMP-9的表達(dá)水平，最終促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移?；趍iR-301a在結(jié)腸癌中的作用，因此miR-301a不是為結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)有價(jià)值的生物預(yù)警分子，對(duì)結(jié)腸癌的分期和預(yù)后治療具有重要的提示意義。

1 Park S，Hur H，Min BS，etal.Short-term outcomes of an extralevator abdominoperineal resection in the prone position compared with a conventional abdominoperineal resection for advanced low rectal cancer：the early experience at a single institution〔J〕.Ann Coloproctol，2016；32(1)：12-9.

2 Wecker T，Hoffmeier K，Plotner A，etal.MicroRNA profiling in aqueous humor of individual human eyes by next-generation sequencing〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2016；57(4)：1706-13.

3 Goncalves-Junior R，Pinheiro-Ada R，Schoichet JJ，etal.MMP13，TIMP2 and TGFB3 gene polymorphisms in Brazilian chronic periodontitis and periimplantitis subjects〔J〕.Braz Dent J，2016；27(2)：128-34.

4 Jafarzadeh M，Soltani BM.Hsa-miR-590-5p interaction with smad3 transcript supports its regulatory effect on the tgfbeta signaling pathway〔J〕.Cell J，2016；18(1)：7-12.

5 Guo YJ，Liu JX，Guan YW.Hypoxia induced upregulation of miR-301a/b contributes to increased cell autophagy and viability of prostate cancer cells by targeting NDRG2〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016；20(1)：101-8.

6 Liang B，Yin JJ，Zhan XR.MiR-301a promotes cell proliferation by directly targeting TIMP2 in multiple myeloma〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015;8(8)：9168-74.

7 Xie H，Li L，Zhu G，etal.Infiltrated pre-adipocytes increase prostate cancer metastasis via modulation of the miR-301a/androgen receptor (AR)/TGF-beta1/Smad/MMP9 signals〔J〕.Oncotarget，2015；6(14)：12326-39.

8 Lu L，Wang J，Lu H，etal.MicroRNA-130a and-130b enhance activation of hepatic stellate cells by suppressing PPARgamma expression：a rat fibrosis model study〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2015;465(3)：387-93.

9 Dou L，Wang S，Sui X，etal.MiR-301a mediates the effect of IL-6 on the AKT/GSK pathway and hepatic glycogenesis by regulating PTEN expression〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015;35(4)：1413-24.

10 Fang Y，Sun B，Xiang J，etal.MiR-301a promotes colorectal cancer cell growth and invasion by directly targeting SOCS6〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015;35(1)：227-36.

11 Di Francesco A，F(xiàn)alconi A，Di Germanio C，etal.Extravirgin olive oil up-regulates CB(1) tumor suppressor gene in human colon cancer cells and in rat colon via epigenetic mechanisms〔J〕.J Nutr Biochem，2015;26(3)：250-8.

12 Ching T，Song MA，Tiirikainen M，etal.Genome-wide hypermethylation coupled with promoter hypomethylation in the chorioamniotic membranes of early onset pre-eclampsia〔J〕.Mol Hum Reprod，2014;20(9)：885-904.

13 Xu XD，He XJ，Tao HQ，etal.Abnormal expression of miR-301a in gastric cancer associated with progression and poor prognosis〔J〕.J Surg Oncol，2013;108(3)：197-202.

14 Huang L，Liu Y，Wang L，etal.Down-regulation of miR-301a suppresses pro-inflammatory cytokines in Toll-like receptor-triggered macrophages〔J〕.Immunology，2013;140(3)：314-22.

15 Ma F，Chen D，Chi Y，etal.The expression and role of miR-301a in human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells〔J〕.Cytotherapy，2013;15(12)：1511-6.

16 Anderson SE，Beezhold K，Lukomska E，etal.Expression kinetics of miRNA involved in dermal toluene 2，4-diisocyanate sensitization〔J〕.J Immunotoxicol，2014;11(3)：250-9.

〔2016-12-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

湖北省科技廳資助項(xiàng)目(No.30211176)

徐 虎(1969-)，男，主治醫(yī)師，主要從事臨床外科研究。

R735.3+5

A

1005-9202(2017)08-1825-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.002

1 湖北省腫瘤醫(yī)院肝膽胰科 2 湖北省人民醫(yī)院泌尿外科