饒春梅 成細(xì)華 任 婷 孫彥波 彭 霞 黃政德

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

·基礎(chǔ)研究·

加味丹參飲含藥血清預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5和Beclin1 mRNA表達(dá)的影響

饒春梅 成細(xì)華 任 婷 孫彥波 彭 霞 黃政德

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

目的 探討加味丹參飲含藥血清預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞自噬及其相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)的影響。方法 將體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為空白血清組(CG)、缺氧/復(fù)氧組(HRG)、加味丹參飲含藥血清組(JDG)、JDG+自噬抑制劑(3-MA)組(JIG)、JDG+自噬激動(dòng)劑(RAPA)組(JAG)。倒置顯微鏡觀察各組心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化；MTT比色法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率；透射電子顯微鏡觀察心肌細(xì)胞自噬體形態(tài)及數(shù)量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)。結(jié)果 與CG比較，HRG鏡下心肌細(xì)胞變性壞死程度增加，細(xì)胞存活率下降(P<0.01)，電鏡下自噬體增多，實(shí)時(shí)熒光定量PCR示Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)上調(diào)；與HRG相比，JDG及JAG鏡下心肌細(xì)胞變性壞死程度減輕，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)，電鏡下自噬體增加，Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 加味丹參飲預(yù)處理通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞自噬，保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷H9C2心肌細(xì)胞。

加味丹參飲含藥血清；H9C2心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧損傷；自噬；Atg5 mRNA；Beclin1 mRNA

隨著靜脈溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)等方法治療急性心肌梗死的廣泛開(kāi)展，急性心肌梗死患者的預(yù)后得到明顯改善。但是隨之而來(lái)的心肌缺血再灌注(IR)損傷卻嚴(yán)重制約著上述方法的救治成功率，因此，心肌IR損傷機(jī)制及心肌保護(hù)的研究一直是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一。自噬對(duì)維持正常心臟形態(tài)和心肌功能起到重要作用，在心肌IR損傷過(guò)程中扮演重要角色〔1〕。益氣活血中藥復(fù)方加味丹參飲對(duì)IR損傷心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，通過(guò)抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等途徑抗心肌細(xì)胞損傷〔2～4〕。本研究在此基礎(chǔ)上觀察加味丹參飲含藥血清預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞自噬及其相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討該方抗心肌細(xì)胞IR損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 H9C2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250～280 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK(湘)2013-0005，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，用于制備動(dòng)物血清。

1.2 藥物 加味丹參飲中藥購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。水煎2次，合并煎液，過(guò)濾濃縮至2 g生藥/ml，置于4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑與儀器 3-甲基腺嘌呤(3-MA,S24823-1g 上海源葉),雷帕霉素(Rapamycin，S17098-100 mg 上海源葉)。高糖(4.5 g/L)DMEM(SH30022.01，Hyclone)，胎牛血清(blz-000211,GIBCO)，0.25%胰酶-EDTA(blz-0193，GIBCO)，青鏈霉素混合液(10378，GIBCO)，DMSO(D2650，Sigma)，MTT(MT120C，Spectrum)，PBS(blz-0099，Solarbio)，qRT-PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司提供。Trizol(Sigma)，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，SYBR Premix Ex Taq(Takara)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(HF160W,力康)，超凈工作臺(tái)(JB-CJ-2B，常州普天儀器)，倒置顯微鏡(XD-202，上海)，酶標(biāo)儀(BioTek,美國(guó))，PCR儀(2400 PCR System,perkin Elmer)，Real-time PCR儀(7900 HT System,ABI),臺(tái)式低速微量離心機(jī)(Eppendorf)，日立H7700透射電鏡。

1.4 加味丹參飲含藥血清制備 40只SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組20只。加味丹參飲按臨床體表面積換算，相當(dāng)于人臨床用藥劑量的8倍〔5〕。含藥血清組大鼠以生藥59.28 g/kg、2次/d灌胃，連續(xù)7 d；空白血清組給予等體積蒸餾水灌胃。于末次給藥后1 h,無(wú)菌條件下，腹主動(dòng)脈插管取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清。56℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌,分裝,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋成體積分?jǐn)?shù)含藥血清。

1.5 H9C2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將H9C2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞用培養(yǎng)液(90%高糖DMEM液+10%胎牛血清+1% 青鏈霉素)在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)用0.25% 胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并傳代。

1.6 缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型的建立 參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》〔6〕和本課題組建立的模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)〔7〕。DMEM培養(yǎng)液用高純氮?dú)怙柡?0 min，使培養(yǎng)液氧分壓低于4.0 kPa(30 mmHg)，得缺氧培養(yǎng)液。心肌細(xì)胞單層換用缺氧培養(yǎng)液后，培養(yǎng)液內(nèi)立即充入氮?dú)?1 L/min流量)30 s以驅(qū)除瓶?jī)?nèi)氧氣，然后塞緊瓶塞密閉培養(yǎng)。缺氧不同時(shí)間后可造成心肌細(xì)胞不同程度的損害。按此方法造成心肌細(xì)胞缺氧，缺氧2 h后換用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h，造成再給氧損傷。

1.7 分組及給藥 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為5組，每組6孔，①空白血清組(CG)：在含15%空白血清培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)29 h；②缺氧/復(fù)氧組(HRG)：在含15%空白血清培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換缺氧培養(yǎng)液，缺氧2 h，再給氧3 h；③加味丹參飲含藥血清組(JDG)：在含15%藥物血清中常規(guī)培養(yǎng)24 h，缺氧2 h，再給氧3 h；④ JDG+自噬抑制劑(3-MA)組(JIG)：3-甲基腺嘌呤(10 mmol/L)預(yù)處理30 min，余同③；⑤JDG+自噬激動(dòng)劑(RAPA)組(JAG)：雷帕霉素(100 nmol/L)預(yù)處理30 min，余同③。

1.8 MTT法測(cè)定不同濃度含藥血清對(duì)H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2(2-1)心肌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，以5×104個(gè)/ml密度接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁后換為6個(gè)不同濃度含藥血清(5%、10%、15%、20%、25%、30%)，空白對(duì)照組加入等量含正常血清的DMEM培養(yǎng)液，24 h后各孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl,常規(guī)培養(yǎng)4 h后吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μl,低速振蕩10 min混勻，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為490 nm時(shí)測(cè)定吸光度(OD值)。細(xì)胞存活率(%)=(給藥孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(空白孔OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.9 倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化 倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化并拍照。

1.10 MTT法檢測(cè)加味丹參飲含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2心肌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，以5×104個(gè)/ml密度接種于96孔板，每孔100 μl，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，貼壁后按上述方式分組給藥，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.11 透射電子顯微鏡觀察各組心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體形態(tài)及數(shù)量 各組細(xì)胞經(jīng)上述處理后，收集細(xì)胞，加入2.5%戊二醛溶液固定過(guò)夜(4℃)，次日用磷酸鹽緩沖液洗滌4次，15 min/次，1%鋨酸溶液4℃固定2 h后梯度丙酮脫水(50%、70%、90%、100%)，依次經(jīng)滲透、包埋、聚合、切片、染色等步驟后用透射電鏡觀察自噬體形態(tài)及數(shù)量多少。

1.12 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá) 收集培養(yǎng)細(xì)胞，按Trizol試劑盒方法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度及濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA作為模板，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法對(duì)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對(duì)照組。差別倍數(shù)=2-△△Ct，正常對(duì)照組的數(shù)值設(shè)為1。引物序列：β-actin：5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'和5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'；Beclin-1：5'-CTCGTCAAGGCGTCACTTCT-3' 和5'-CCTTAGACCCCTCCATTCCTC-3'；Atg5：5'-TGAGCCTGACCTTGCTTCAG-3'和5'-GTGCCTGTTAATCGGACATGG-3'。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法測(cè)定不同濃度加味丹參飲含藥血清對(duì)細(xì)胞存活率的影響 與CG〔(95.10±1.83)%〕比較，各組細(xì)胞存活率均降低(P<0.01)，其中，5%含藥血清組〔(84.09±5.55)%〕、20%含藥血清組〔(82.75±5.55)%〕、25%含藥血清組〔(59.61±5.55)%〕及30%含藥血清組〔(41.47±8.71)%〕細(xì)胞存活率顯著降低，而10%含藥血清組〔(91.10±8.71)%〕及15%含藥血清組〔(89.43±5.54)%〕細(xì)胞存活率差異無(wú)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且較5%、20%、25%、30%含藥血清組細(xì)胞存活率升高(P<0.01)，故選用15%含藥血清為最佳工作濃度。

2.2 加味丹參飲含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化的影響 倒置顯微鏡下，CG細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形，折光性大，培養(yǎng)液中見(jiàn)極少量的細(xì)胞懸??；HRG鏡下見(jiàn)大量細(xì)胞懸浮，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，折光性降低，細(xì)胞間空隙增大，胞質(zhì)中有空泡及顆粒；JDG及JAG細(xì)胞形態(tài)較HRG明顯改善；JIG細(xì)胞形態(tài)與HRG相似，見(jiàn)圖1。

圖1 加味丹參飲含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)變化的影響(×400)

2.3 加味丹參飲含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率的影響 與CG〔(94.84±0.43)%〕比較，各組細(xì)胞存活率均降低(P<0.01)，其中，JDG〔(86.84±1.0)%〕及JAG〔(86.90±1.24)%〕組間細(xì)胞存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與HRG〔(41.94±1.50)%〕比較,JDG及JAG細(xì)胞存活率均顯著升高(P<0.01)，而JIG(41.95±1.86 %)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 透射電子顯微鏡觀察各組心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體形態(tài)及數(shù)量 CG胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯自噬體形成；缺氧2 h、復(fù)氧3 h后(HRG)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量包含胞質(zhì)內(nèi)容物的膜狀結(jié)構(gòu)(自噬體)；予加味丹參飲預(yù)處理后(JDG)自噬體數(shù)量增多；加用自噬激動(dòng)劑后(JAG)自噬體數(shù)目進(jìn)一步增加，予自噬抑制劑后(JIG)自噬體數(shù)量減少，見(jiàn)圖2。

2.5 加味丹參飲含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)的影響 與CG比較，各組Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.01)；與HRG比較，JDG及JAG組間Atg5 mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步升高(P<0.05)，而JIG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CG比較，除JIG，其余各組Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.01)；與HRG比較，JDG及JAG進(jìn)一步升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 加味丹參飲含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬體形態(tài)及數(shù)量的影響(×10 000)

與CG比較：1)P<0.01，與HRG比較：2)P<0.01 圖3 加味丹參飲含藥血清對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)容物被降解及循環(huán)利用的過(guò)程，廣泛存于真核生物中，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)起重要作用〔8，9〕，且參與機(jī)體包括感染、腫瘤、神經(jīng)退行性病變、心肌缺血再灌注損傷等在內(nèi)的多種病理生理過(guò)程。作為真核生物中保守的降解途徑，細(xì)胞自噬是機(jī)體在饑餓條件下的一種存活機(jī)制，可在多種類(lèi)型脅迫期間保護(hù)細(xì)胞，研究表明急性或慢性心肌缺血中自噬均增加，通過(guò)降解胞質(zhì)內(nèi)長(zhǎng)壽命蛋白等，為關(guān)鍵的生命活動(dòng)提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。然而，自噬也可參與一種與凋亡截然不同的程序性細(xì)胞死亡(Ⅱ型程序性死亡)。在心肌再灌注階段，自噬程度進(jìn)一步增強(qiáng)，對(duì)于自噬在心肌IR損傷中起保護(hù)作用還是損傷作用目前尚無(wú)統(tǒng)一定論。Decker等〔10〕觀察到，在再灌注心肌細(xì)胞內(nèi)自噬泡增多，且自噬泡內(nèi)含有受損傷的線粒體，提示由自噬上調(diào)介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用可能與其清除受損線粒體有關(guān)。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞采用缺氧再給氧模擬缺血再灌注時(shí)，用siRNA阻斷Beclin1或用PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤抑制自噬，可減少再灌注時(shí)心肌細(xì)胞的死亡〔11〕。本研究表明，體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞缺氧2 h，再給氧3 h后自噬泡增多，但心肌細(xì)胞存活率降低，心肌細(xì)胞損傷加重，予加味丹參飲預(yù)處理24 h后再予缺氧再給氧處理，自噬泡結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增多，并伴隨心肌細(xì)胞存活率增加，心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及損傷程度改善，提示在此模型中加味丹參飲通過(guò)上調(diào)自噬保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷H9C2心肌細(xì)胞。

自噬是受到嚴(yán)密調(diào)控的動(dòng)態(tài)過(guò)程，包括自噬的誘導(dǎo)、運(yùn)載物的識(shí)別和包裝、囊泡成核、囊泡擴(kuò)展和閉合、Atg蛋白循環(huán)、囊泡與液泡/溶酶體融合、囊泡分解，以及所產(chǎn)生的大分子物質(zhì)的循環(huán)利用。其中，Atg5通過(guò)形成Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物主要定位于吞噬泡的外側(cè)，在自噬體形成期間驅(qū)動(dòng)膜片的擴(kuò)展和/或彎曲，是參與調(diào)控自噬的重要基因。Beclin1與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(Vps34)形成Beclin1/Vps34復(fù)合物，通過(guò)使其他Atg蛋白重定位于前自噬體結(jié)構(gòu)而促進(jìn)自噬體的形成，3-甲基腺嘌呤可通過(guò)干擾Beclin1復(fù)合物中hVps34的活性來(lái)抑制自噬。Boya等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，采用敲除或沉默Atg基因(Atg5、Atgl0、Atgl2及Beclin1)或使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)、羥氯喹、渥曼青霉素等藥物抑制自噬均可增加營(yíng)養(yǎng)匱乏環(huán)境中細(xì)胞的凋亡和死亡。本研究顯示，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組心肌組織Atg5及Beclin1 mRNA表達(dá)，加味丹參飲組較缺氧/復(fù)氧組Atg5及Beclin1 mRNA表達(dá)均上調(diào)，加用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素后表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可下調(diào)Atg5及Beclin1 mRNA表達(dá)，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與電子顯微鏡下自噬泡數(shù)量變化相一致，表明Atg5及Beclin1基因參與了自噬體的形成。

心肌 IR 損傷屬于中醫(yī)“胸痹”、“真心痛”范疇。史載祥教授〔13〕認(rèn)為冠狀動(dòng)脈血瘀阻絡(luò)與微循環(huán)障礙是心肌IR損傷和再灌注治療后的重要病理生理機(jī)制，活血化瘀成為研究后再灌注時(shí)代難題的主要途徑。結(jié)合中醫(yī)氣血理論：“氣能生血，血為氣母”、“氣為血帥”，益氣活血法成為中醫(yī)防治心肌IR損傷的重要治則。本研究所用加味丹參飲即以益氣活血法立法組方，課題組前期研究顯示該方可通過(guò)抗氧化，抗炎癥，抗凋亡等途徑抗心肌細(xì)胞損傷〔2～4〕，本研究進(jìn)一步表明該方可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬抗H9C2心肌細(xì)胞損傷。劉杰民等〔14〕認(rèn)為細(xì)胞自噬是機(jī)體正氣虧虛下的自救方式，是體內(nèi)內(nèi)生瘀血痰濁之邪的自我清除途徑；李欣志等〔15〕提出心肌細(xì)胞自噬可能是心臟陰陽(yáng)自和的微觀基礎(chǔ)。因此，氣虛(屬陽(yáng)，細(xì)胞自噬功能下降)血瘀(屬陰，細(xì)胞凋亡和死亡上升)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞自我保護(hù)功能下降，從益氣活血角度出發(fā)，激發(fā)心肌細(xì)胞自噬，調(diào)節(jié)心臟陰陽(yáng)自和，可能是中醫(yī)藥防治心肌IR損傷的新靶點(diǎn)。

綜上所述，益氣活血中藥復(fù)方加味丹參飲預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷H9C2心肌細(xì)胞具有延遲保護(hù)作用，該機(jī)制可能與其上調(diào)自噬相關(guān)基因Atg5及Beclin1 mRNA表達(dá)，上調(diào)自噬水平相關(guān)。但自噬對(duì)細(xì)胞的生存具有雙重作用，如何通過(guò)精細(xì)調(diào)控自噬減輕心肌缺血再灌注損傷仍需進(jìn)一步深入探究。

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〔2016-10-19修回〕

(編輯 李相軍)

Influence of preconditioning with Jiawei Danshen decoction on expression level of autophagy related gene Atg5 and Beclin1 in H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury

RAO Chun-Mei,CHENG Xi-Hua,REN Ting,etal.

Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China

Objective To investigate the influence of preconditioning with Jiawei Danshen decoction on expression level of autophagy related gene Atg5 and Beclin1 in H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury.Methods H9C2 cardiomyocytes cultured in vitro were randomly divided into control group(CG),hypoxia/reoxygenation group(HRG),Jiawei Danshen decoction group(JDG),JDG+3-methyladenine(a inhibitor of autophagy) group(JIG) and JDG +Rapamycin(RAPA)(an agonists of autophagy)group (JAG).The inverted microscope was used to observe cell growth and morphological changes.The cell viability of H9C2 cardiomyocytes were measured by MTT assay.Transmission electron microscope was applied to observe the changes of autophagosome formation in cardiomyocytes.The expression levels of Atg5 and Beclin1 mRNA were determined by qRT-PCR.Results Compared with those of CG,the degree of cell necrosis and damage were rised in HRG,the cell viability was declined(P<0.01),the autophagosome formation in cardiomyocytes was increased.Meanwhile,the expression levels of Atg5 and Beclin1gene were up-regulated compared with those of HRG,the cardiomyocyte morphological structure of JDG and JAG were improved,the cell viability of JDG and JAG were increased significantly(P<0.01),the autophagosome formation in cardiomyocytes were increased.In addition,the expression levels of Atg5 and Beclin1gene were up-regulated(P<0.05).Conclusions Preconditioning with Jiawei Danshen decoction has a protective effect on H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury by up-regulating the expression levels of Atg5 and Beclin1gene.

Jiawei Danshen decoction medicated serum;H9C2 cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation injury;Autophagy;Atg5 mRNA；Beclin1 mRNA

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373576，81503536);湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)課題(201304);湖南省教育廳項(xiàng)目(14B136，14C0872);湖南省科技廳一般項(xiàng)目(2014SK3034);湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(14B136);中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病的相關(guān)基礎(chǔ)研究湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)科研項(xiàng)目

成細(xì)華(1974-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的研究。 黃政德(1955-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事心血管疾病的中醫(yī)藥防治研究。

饒春梅(1989-)，女，在讀碩士，主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1821-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.001