劉華君，聶志勇，林明，白曉山，鄧超宏，潘竟海，陳友強(qiáng)，李承業(yè)*

試驗(yàn)研究

利用ISSR標(biāo)記分析20份甜菜品種的遺傳多樣性

劉華君1，聶志勇2，林明1，白曉山1，鄧超宏1，潘竟海1，陳友強(qiáng)1，李承業(yè)1*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052）

針對來源于德國的18份甜菜品種和來源于瑞士的2份甜菜品種進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建和聚類分析。以5份甜菜種質(zhì)資源為材料，對引物UBC801～UBC900等100個(gè)引物進(jìn)行篩選，篩選出多態(tài)性好的ISSR引物7個(gè)。利用7個(gè)ISSR引物擴(kuò)增適宜新疆種植的20份甜菜種質(zhì)資源，共獲得39個(gè)等位變異，每對引物檢測到的等位變異數(shù)的變幅為3～8個(gè)，平均等位變異數(shù)5.6個(gè)。其中多態(tài)性條帶為30條，7對ISSR引物的多態(tài)信息含量（PIC）的變化范圍為0.6273～0.8360，平均為0.7650，20份參試品種遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.4615～0.9231，平均為0.6923。供試20份甜菜品種遺傳多樣性豐富。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地用于甜菜品種資源評價(jià)和指紋圖譜構(gòu)建。

甜菜；遺傳多樣性；ISSR；種質(zhì)資源

甜菜（Beta vulgaris L.）屬于二年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲西部和南部沿海[1]，是世界兩大糖料作物之一。在我國已栽培百年有余，但由于中國不是起源國，缺少種質(zhì)資源，育種水平提升緩慢[2]。近年來，隨著植物分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，使得作物分析進(jìn)入了新的分子水平層次，而分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后的一種新型遺傳標(biāo)記[3]，目前我國對于甜菜品種的鑒別依然采用的是形態(tài)學(xué)方法[4]。此種方法不僅鑒定周期長而且準(zhǔn)確率低。分子標(biāo)記技術(shù)具有簡單、共顯性、條帶清晰、重復(fù)性好等特點(diǎn)[5]，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到作物品種的鑒定。目前甜菜引物已經(jīng)有上千對[6]，利用該技術(shù)對新疆甜菜品種資源進(jìn)行比較分析，從而可確定種質(zhì)的遺傳多樣性，對選育優(yōu)良品種提供相對準(zhǔn)確的依據(jù)。

ISSR技術(shù)具有重復(fù)性高、程序相對簡單、不需要已知序列信息的特點(diǎn)[7-8]，且針對重復(fù)序列含量高的物種，利用ISSR法可與RFLP、RAPD等分子標(biāo)記相媲美，因此，被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性和進(jìn)化生物學(xué)等研究。分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜研究中應(yīng)用得相對較晚，可對比和參考的文獻(xiàn)較少，但已經(jīng)在某些作物DNA指紋圖譜[9]，重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位[10]，種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析與品種指紋圖譜[11-12]、純度鑒定[13]等方面取得了某些成果。為了甜菜種質(zhì)資源更好地開發(fā)與利用，本研究以20份新疆種植的甜菜品種為材料，利用7對ISSR引物對其進(jìn)行多樣性評價(jià)，研究結(jié)果可用于甜菜品種資源評價(jià)和指紋圖譜構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1供試材料

從國外引進(jìn)品種中選取20份，主要是由德國斯特儒博公司的17份品種以及瑞士先正達(dá)公司的2份，及德國KWS公司的1份。全部供試材料（表1）于2014年4月種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院奇臺縣西地鎮(zhèn)試驗(yàn)田。

1.2基因組DNA的提取和純化

取幼苗時(shí)期甜菜葉片0.20 g，液氮冷凍下研磨成粉末?；蚪MDNA提取采用天根試劑盒法（北京）。用核酸蛋白檢測儀測定DNA濃度，將DNA樣品稀釋到100ng/ μL備用。

表1 供試甜菜品種來源及生物學(xué)特性Table 1 Sugarbeet accessions used in this study

圖1 17個(gè)材料用ctf 2引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of primer ctf 2 in 17 Beta vulgaris resources

1.3多態(tài)性ISSR引物篩選

以編號為1～5材料的基因組DNA為模板，對引物UBC801～UBC900等100個(gè)ISSR引物（北京博邁德生物工程有限公司合成）進(jìn)行多態(tài)性篩選，從中選取擴(kuò)增條帶清晰，條帶數(shù)較多，重復(fù)性較好的7條引物（見圖1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4ISSR標(biāo)記擴(kuò)增及電泳檢測

PCR擴(kuò)增總體系為15 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，Mg2+（2.0 mmol/L）2.5 μL，dNTP（200 μmol/L）1μL，0.3 μL Taq酶（1 U北京天根生物技術(shù)有限公司），DNA（50 ng/μL）1μL，引物（0.2 μmol/L）1μL，加雙蒸水至反應(yīng)體系為15 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad PTC200 PCR儀（Bio-Rad公司）上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性2 min，50℃和54℃退火1 min，72℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保存。退火溫度因擴(kuò)增產(chǎn)物的效果而調(diào)整。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析（130 V，60 mA，北京六一儀器廠），染色，凝膠成像儀Gel Doc 2000TM（Bio-Rad，USA）觀察照相并記錄。

1.5甜菜DNA指紋圖譜的繪制

分析20份甜菜材料清晰可見的ISSR擴(kuò)增條帶。對于每條ISSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，按照擴(kuò)增條帶的分子量從大到小編號。在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，從而將圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)存于Excel表中。將每個(gè)Excel表格中的0、1序列數(shù)據(jù)陣導(dǎo)入NTSYS-PC 2.10e和ntedit軟件中，進(jìn)行運(yùn)算處理。即可得到參試品種遺傳相似系數(shù)的變異范圍以及從Excle中得出ISSR引物的多態(tài)性信息量（PIC）的變化范圍，從而構(gòu)建出供試20份甜菜種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜。

表2 7對引物特征信息Table 2 Characterization of 7 polymorphic microsatellite loci in the experiment

2 結(jié)果和分析

2.1ISSR標(biāo)記的多態(tài)性

選擇7對多態(tài)性好的引物對20份新疆甜菜材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出39條帶，其中多態(tài)性帶30條，多態(tài)性比率76.92%，每對引物等位變異數(shù)3～8個(gè)，7對引物平均多態(tài)性等位變異數(shù)5.6個(gè)，71%（5個(gè)）位點(diǎn)的等位變異數(shù)超過了5個(gè)。7對ISSR引物的多態(tài)性信息量（PIC）的變化范圍為0.6273～0.8360（表2），平均0.7650，引物最高為UBC801，引物UBC857最小。有2對引物的多態(tài)信息含量高于0.8，占28.6%。

2.2參試品種（系）遺傳相似系數(shù)

利用NTSYS-PC 2.10e遺傳分析軟件，根據(jù)ISSR標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算出品種間的遺傳相似系數(shù)（GS）（圖2），從圖中可以看出除7對引物可以將所有供試材料區(qū)分開，表明不同品種之間具有一定的異質(zhì)性。20份參試甜菜品種遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.46153～0.92307，平均值為0.69230，其中ST13105號與ST21015間的遺傳相似性最低（0.46153）。

2.3聚類分析

依各甜菜品種的遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)為0.77處聚為六大類（圖2）。

圖2 甜菜不同材料的親緣關(guān)系及遺傳多祥性聚類圖Fig.1 Dendrogram generated by cluster analysis for 38 sugarbeet varieties

第一大類只包含有1個(gè)品種，來源于德國斯特儒博公司的ST13012。

第二大類包含有7個(gè)品種，在0.85處可進(jìn)一步劃分為4組。第一組包含有3個(gè)品種分別是來自德國斯特儒博公司的ST13112、ST13109以及SD13829；第二組只包含有來自德國斯特儒博公司的ST14109；第三組包含有兩個(gè)品種，分別是來自德國KWS公司的KWS7125以及來自瑞士先正達(dá)的HI0936；第四組只包含有來自德國斯特儒博公司的ST14091。

第三大類包含有兩個(gè)品種，分別是德國斯特儒博公司的ST13929以及ST21015。

第四大類包含有5個(gè)品種，在0.82處可進(jìn)一步分為3組。第一組包含有兩個(gè)品種來自德國斯特儒博公司的SD13829、ST13092；第二組包括兩個(gè)品種德國斯特儒博公司的ST13029以及ST14024；第三組只含有1個(gè)品種來自瑞士先正達(dá)的HI0466。

第五大類只包含有1個(gè)品種來自德國斯特儒博公司的ST13139。

第六大類包含有4個(gè)品種，在0.85處可進(jìn)一步分為3組。第一組包含有兩個(gè)品種德國斯特儒博公司的ST13039以及ST13105；第二組只包含有一個(gè)品種來自德國斯特儒博公司的ST12927；第三組只包含有德國斯特儒博公司的ST13906。

3 討論

劉巧紅等[14]針對來源于荷蘭的4個(gè)引進(jìn)甜菜品種和國內(nèi)的6個(gè)甜菜品系（其中兩個(gè)為一年生野生甜菜）進(jìn)行了ISSR指紋圖譜構(gòu)建和聚類分析研究。利用篩選的6條引物ISSR-PCR共擴(kuò)增出51個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶百分率為86.3%。遺傳相似性聚類分析結(jié)果顯示，10個(gè)甜菜品種（系）的相似系數(shù)為0.43～0.83，平均為0.62。Liu等[15]在2012年舉行的生物醫(yī)學(xué)工程與生物技術(shù)（iCBEB）國際會議上發(fā)文中指出，利用簡單重復(fù)序列標(biāo)記（ISSR）對來自中國和荷蘭的一共13個(gè)甜菜品種進(jìn)行識別和聚類分析，利用6條多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物進(jìn)行篩選。利用ISSR-PCR與6個(gè)引物得到48條帶，13個(gè)甜菜品種和品系間的多態(tài)率為87.5%，相似系數(shù)范圍是0.46～0.89，平均為0.67。

本研究的7對ISSR引物共擴(kuò)增出39條帶，其中多態(tài)性條帶30條，多態(tài)性比率為76.92%，每對引物等位變異數(shù)3～8個(gè)，7對引物平均多態(tài)性等位變異數(shù)5.6個(gè)，有71%（5個(gè)）位點(diǎn)的等位變異數(shù)超過了5個(gè)。7對ISSR引物的多態(tài)性信息量（PIC）的變化范圍為0.3427～0.7854，平均0.5292；20份參試品種遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.46153～0.92307，平均值為0.6923。引物UBC801最高，引物UBC857最小。有兩對引物的多態(tài)信息含量高于0.8，占28.6%?？梢钥闯鲭m然本研究的多態(tài)率比劉巧紅等人少，但遺傳相似系數(shù)變化范圍以及平均值均比前人的研究結(jié)果大，這可能是由于本研究無論是引物數(shù)量還是參試品種數(shù)都較前人多的原因。且本研究充分利用ISSR標(biāo)記準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，20個(gè)品種等位變異數(shù)較多，有71%超過了5個(gè)，因而具有較高的準(zhǔn)確性。參試品種雖大部分來自同一個(gè)公司，但依然可得出本試驗(yàn)的參試甜菜品種的遺傳多樣性較高。

4 結(jié)論

本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究在新疆種植的20份甜菜栽培品種的遺傳多樣性，通過篩選得到了7對適合甜菜的引物，共擴(kuò)增出39條引物，其中多態(tài)條帶為30條，7對ISSR引物的多態(tài)性信息量（PIC）的變化范圍為0.3427～0.7854，平均0.5292；20份參試品種遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.46153～0.92307，平均值為0.6923。供試20份甜菜品種遺傳多樣性豐富，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地用于甜菜品種資源評價(jià)和指紋圖譜構(gòu)建。新疆甜菜栽培地區(qū)氣候及地理差異較大，需要不同特性的品種以適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颍倚陆皇翘鸩说陌l(fā)源地，沒有較多的種質(zhì)資源用于育種研究。因而了解適宜新疆種植的甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性無論是引種還是育種都顯得尤為重要。通過本研究可以看出適宜新疆種植的甜菜品種遺傳多樣性比較豐富，但不同育種單位之間還是應(yīng)加強(qiáng)甜菜種質(zhì)資源交流和交換以加強(qiáng)新疆甜菜品種的遺傳多樣性和品種適應(yīng)性。

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Genetic Diversity Analysis of Sugarbeet Cultivars by ISSR Marker

LIU Hua-jun1，NIE Zhi-yong2，LIN Ming1，BAI Xiao-shan1，DENG Chao-hong1，PAN Jing-hai1，CHEN You-qiang1，LI Cheng-ye1*
(1.Research Institute of Industrial Crops,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China；2.College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830091，China)

A genetic map and cluster analysis for 18 sugarbeet varieties from Germany and 2 sugar sugarbeet cultivars from Switzerland were built.Five sugarbeet germplasms were used as material to screen 100 primers (UBC801～UBC900)and obtained 7 ISSR with high polymorphism.Seven ISSR primers were used to fulfill amplification of 20 sugarbeet germplasms,and got total of 39 allelic variation,It was detected that the amplitude for number of alleles was 3～8 from each pair of primers,the average number of alleles was 5.6.Among them the number of polymorphic bands are 30,polymorphic information content(PIC)of 7 pairs SSR primers range of variation was 0.6273～0.8360,with an average of 0.7650.The genetic similarity coefficient of 20 beet germplasms was 0.4615～0.9231,with an average of 0.6923.Conclusion：there existed abundant genetic diversity among 20 sugarbeet and their relationships were significantly correlated with countries'distribution.ISSR molecular markers could be effectively used in genetic diversity and fingerprint analysis for sugarbeet.

sugarbeet;genetic diversity;ISSR;germpoasm resources

S566.3

：A

：1007－2624（2017）03－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.03.001

2017-03-09

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目-甜菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系瑪納斯綜合試驗(yàn)站（CARS-210410）。

劉華君（1970-），男，副研究員，研究方向?yàn)樘鸩诉z傳育種與栽培，E-mail：13899962328@163.com。

李承業(yè)（1955-），男，推廣研究員，研究方向?yàn)樘鸩嗽耘?，E-mail：lcy7679@126.com。