郭映輝, 何寶花, 王穎童, 賈肇一, 王 茜, 李貴霞, 張文超, 孫印旗, 陳素良

(1 河北省兒童醫(yī)院，河北 石家莊 050031； 2 河北省疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050021)

·論著·

182株兒童患者肺炎鏈球菌的分子生物學(xué)鑒定及分型

郭映輝1, 何寶花2, 王穎童2, 賈肇一2, 王 茜2, 李貴霞1, 張文超1, 孫印旗2, 陳素良2

(1 河北省兒童醫(yī)院，河北 石家莊 050031； 2 河北省疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050021)

目的 對(duì)來自患兒的肺炎鏈球菌進(jìn)行分型，為肺炎鏈球菌疫苗的正確選擇提供科學(xué)依據(jù)。方法 收集2014年來自河北省兒童醫(yī)院的182株肺炎鏈球菌，普通PCR對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行種屬鑒定，應(yīng)用多重PCR方法對(duì)菌株進(jìn)行菌型分析。結(jié)果 經(jīng)PCR檢測(cè)182株菌的cpsA基因擴(kuò)增均為陽性；經(jīng)多重PCR檢測(cè)，除8株未分型菌株外，其余174株肺炎鏈球菌中，以19F、19A和6A/6B型數(shù)量最多，分別為68株(37.36%)、33株(18.13%)和26株(14.28%)，其余型別有35B型、14型、6C/6D型、23F型、15B/15C型等。結(jié)論 182株肺炎鏈球菌的菌型主要為19F、19A和6A/6B，為該省肺炎鏈球菌疫苗的正確選擇和制訂使用策略提供了科學(xué)依據(jù)。

肺炎鏈球菌； 多重PCR； 菌型鑒定； 種屬鑒定；cps基因

[Chin J Infect Control，2017，16(4)：326-329]

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae, Sp)感染是重要的全球性疾病，可引起肺炎、嬰幼兒急性化膿性中耳炎和細(xì)菌性腦膜炎，每年全球至少有100萬左右5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌相關(guān)疾病，2歲以下兒童受到的危害更嚴(yán)重[1]。由于肺炎鏈球菌的高發(fā)病率和致死率，其疫苗推廣十分重要，但目前疫苗的保護(hù)范圍有限，無法覆蓋所有菌型。因此，為正確和有效地免疫兒童，迫切需要了解肺炎鏈球菌菌型種類及其分布情況。

莢膜是肺炎鏈球菌最主要的致病因子，其生成主要由莢膜合成基因簇(cps)調(diào)控，該基因幾乎存在于所有肺炎鏈球菌中，且高度保守，本研究中用于鑒定肺炎鏈球菌的cpsA引物以及用于分型的引物大多來自cps基因簇，且大多經(jīng)Southen印跡實(shí)驗(yàn)的檢驗(yàn)[2]?；赑CR技術(shù)的分子鑒定及分型方法敏感性高，操作簡(jiǎn)便，成本較低，已經(jīng)成為肺炎鏈球菌血清分型的首選方法。世界衛(wèi)生組織(WHO)手冊(cè)在關(guān)于流行性腦膜炎、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌引起的腦膜炎診斷方法一節(jié)介紹了肺炎鏈球菌的PCR分型方法[3]。本研究利用分子生物學(xué)方法對(duì)2014年河北省兒童醫(yī)院分離的182株來自兒童患者的肺炎鏈球菌進(jìn)行分型，初步了解該省兒童患者致病性肺炎鏈球菌菌型特點(diǎn)，科學(xué)評(píng)價(jià)該省現(xiàn)行的肺炎鏈球菌疫苗使用策略，為肺炎鏈球菌疫苗的正確選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2014年河北省兒童醫(yī)院對(duì)臨床診斷為大葉性肺炎、氣管炎、中耳炎、胸膜炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等病例進(jìn)行相關(guān)標(biāo)本采集，標(biāo)本經(jīng)初步生化鑒定共分離182株肺炎鏈球菌，全部納入研究。菌株分離自痰、血、腦脊液、肺泡灌洗液、臀部膿腫穿刺液、胸腔積液、氣管內(nèi)分泌物、眼分泌物和關(guān)節(jié)腔膿液等標(biāo)本，所有菌株均分離自8歲以下兒童，其中150株來自2歲以下兒童。

1.1.2 儀器與試劑 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自廣州市迪景微生物科技有限公司，PCR Premix體系、DNA Marker購自大連寶生物工程公司，引物由北京華大基因公司合成。9700型普通PCR儀為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)，5417型離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)，1285型生物安全柜為美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱為日本三洋公司生產(chǎn)，164-5050型電泳儀為美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)，G Box F3型紫外凝膠成像儀為英國(guó)Syngene公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制備 將收集的菌株接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，置CO2培養(yǎng)箱中，在5% CO2、35 ℃條件下培養(yǎng)18～20 h。挑取一定量的新鮮培養(yǎng)物，懸浮于200 μL超純水中，渦旋振蕩，沸水浴20 min后，12 000 r/min離心5 min，吸取上清液制備菌株DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株種屬鑒定 對(duì)菌株進(jìn)行種屬特異性基因cpsA的普通PCR鑒定，引物序列cpsA-F：GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC，cpsA-R：GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，在濃度為1.0%瓊脂糖中進(jìn)行電泳，電壓為5 V/cm，電泳1 h，紫外凝膠成像儀觀察并采集圖像。

1.2.3 多重PCR分型 分9個(gè)反應(yīng)依次對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR分型，每個(gè)反應(yīng)均包括多對(duì)不同的血清型引物及作為內(nèi)對(duì)照的cpsA引物，引物序列參照文獻(xiàn)[3]報(bào)道，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃再延伸10 min，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，在濃度為1.0%瓊脂糖中進(jìn)行電泳，電壓為5 V/cm，電泳1 h，紫外凝膠成像儀觀察并采集圖像。根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，確定樣品所屬型別。引物分組見表1。

表1 多重PCR引物分組情況

*：當(dāng)6(6A/6B/6C/6D)為陽性時(shí)，進(jìn)行第9組多重PCR，若6C/6D型檢測(cè)陽性即為此型，否則為6A/6B型

2 結(jié)果

2.1 菌株種屬鑒定結(jié)果 182株菌經(jīng)PCR鑒定，cpsA基因均為陽性。

2.2 多重PCR分型檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)多重PCR分型檢測(cè)，19F、19A和6A/6B三種菌型所占比率最多，分別為37.36%、18.13%和14.28%。圖1為部分菌株第3組多重PCR電泳圖，菌株均在160 bp處有一條帶，此條帶為內(nèi)參基因cpsA條帶。菌株1和9在677 bp 處有一電泳條帶，菌型為35B；菌株2～7和10在304 bp 處有一條帶，菌型為19F；菌株8和11為陰性。圖2為部分菌株第1組多重PCR電泳圖，菌株均在160 bp處有一條帶，菌株1在566 bp 處有一電泳條帶，菌型為19A，菌株3在250 bp 處有一條帶，菌型為6。其余菌株的型別為：35B型(9株)、14型(7株)、6C/6D型(6株)、23F型(6株)、15B/15C型(5株)、1型(4株)、24型(24A/24B/24F)(2株)、3型(2株)、7C/7B/40型(2株)、5型(1株)、12F/12A/44/46型(1株)、35A/35C/42型(1株)、15A/15F型(1株)；有8株菌不能分型。見表2。

M：DNA Marker；1～11：1～11號(hào)肺炎鏈球菌

Figure 1 Electrophoresis map of multiplex PCR products of group 3S.pneumoniae

M：DNA Marker；1～4：1～4號(hào)肺炎鏈球菌

Figure 2 Electrophoresis map of multiplex PCR products of group 1S.pneumoniae

3 討論

肺炎鏈球菌是嚴(yán)重危害兒童和老年人身體健康的病原菌之一。目前已知的肺炎鏈球菌有90多個(gè)血清型/群，只有少部分血清型/群能夠?qū)е氯巳喊l(fā)病[4]，但能引起所有年齡組的高發(fā)病率和病死率，在世界范圍內(nèi)是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[5]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種分子生物學(xué)手段應(yīng)用到病原微生物學(xué)的研究中，其中PCR方法是一種靈敏性高、操作簡(jiǎn)便、成本較低的方法，可廣泛應(yīng)用于肺炎鏈球菌的日常監(jiān)測(cè)工作。莢膜是肺炎鏈球菌最主要的致病因子，而莢膜的產(chǎn)生主要是由莢膜合成基因簇(cps)調(diào)控的，它幾乎存在于所有肺炎鏈球菌基因組中，用cpsA引物鑒定肺炎鏈球菌方便準(zhǔn)確。目前，肺炎鏈球菌的血清學(xué)分布監(jiān)測(cè)工作主要是對(duì)收集菌株進(jìn)行培養(yǎng)及血清學(xué)鑒定，所用血清比較昂貴，結(jié)果解釋對(duì)操作人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，是血清學(xué)分群/型的主要缺點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織推薦的建立在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的血清分型技術(shù)可以克服傳統(tǒng)血清分群/型技術(shù)的不足，用于臨床上一些不能直接用血清鑒定菌株的分型，以及對(duì)傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法不敏感菌株的檢測(cè)[3, 6]，且無主觀偏差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠，操作便捷、省時(shí)，成本較低，該分型方法是以cpsA基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)一系列引物，建立起來的檢測(cè)血清型的多重PCR方法[7]。通過比較分析美國(guó)、巴西和南非等國(guó)家分離的菌株，證實(shí)多重PCR分型方法與傳統(tǒng)的血清型方法具有良好的相關(guān)性[8-9]。但本研究中所采用的分子生物學(xué)方法鑒定肺炎鏈球菌種屬及型別也存在一定的局限性，雖cpsA基因序列高度保守，但也有文獻(xiàn)報(bào)道由于基因的缺失或突變導(dǎo)致極少數(shù)菌株不能擴(kuò)增出cpsA基因[10]，但本研究中未發(fā)現(xiàn)類似情況。

表2 肺炎鏈球菌分型結(jié)果及構(gòu)成比

肺炎鏈球菌的發(fā)病率及病死率較高，而疫苗的使用是一種有效的預(yù)防手段，目前全球較常見的肺炎鏈球菌疫苗有7價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗(PCV 7)、13價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗(PCV 13)和23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗(PPV 23)，疫苗的使用可以使肺炎鏈球菌相關(guān)疾病的發(fā)病率明顯降低、呈現(xiàn)較高的保護(hù)力[11]。本研究中所用引物可鑒別肺炎鏈球菌1、3、4、5、6A/B、7A/F、9A/V、14、15A、18A/B/C/F、19A、19F、23F等血清型/群，研究結(jié)果可為正確選擇肺炎鏈球菌疫苗提供科學(xué)依據(jù)，但疫苗的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致血清流行病學(xué)方面的變化[12-13]。近年來，非疫苗覆蓋血清型/群肺炎鏈球菌感染病例逐漸增多，針對(duì)肺炎鏈球菌所開展的監(jiān)測(cè)工作已經(jīng)成為肺炎鏈球菌相關(guān)疾病預(yù)防控制工作的重要組成部分。目前全球范圍內(nèi)6C、6D 型肺炎鏈球菌導(dǎo)致的病例不斷增多[14]，有研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有疫苗對(duì)6C血清型菌株的侵襲沒有保護(hù)性，本研究中有6株肺炎鏈球菌是6C/6D型，占3.30%，需要對(duì)此類菌型進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分型方法能鑒定的肺炎鏈球菌血清型/群有一定局限性，如本試驗(yàn)中有8株肺炎鏈球菌未能分型，另外，一些分型引物為血清群特異性而非血清型特異性，如6A/6B引物陽性結(jié)果的菌株可能是血清型6A或血清型6B，這些需在以后研究中完善。

本研究利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行肺炎鏈球菌種屬及菌型鑒定，為臨床病原微生物的鑒定提供了一種快速、靈敏、客觀和低成本的方法。目前，河北省關(guān)于肺炎鏈球菌菌型情況的相關(guān)報(bào)道較少，本研究中182株肺炎鏈球菌主要血清型為19F、19A和6A/6B，該結(jié)果豐富了該省兒童致病性肺炎鏈球菌的菌型資料，與我國(guó)其他地區(qū)的菌型結(jié)果基本一致[15-16]，目前現(xiàn)有的三種疫苗中，PCV13和PPV23均覆蓋這三種血清型，為肺炎鏈球菌疫苗的正確選擇和制訂肺炎鏈球菌疫苗的使用策略提供了科學(xué)依據(jù)。

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(本文編輯：豆清婭)

Molecular identification and typing of 182 strains ofStreptococcuspneumoniaeisolated from children

GUOYing-hui1,HEBao-hua2,WANGYing-tong2,JIAZhao-yi2,WANGQian2,LIGui-xia1,ZHANGWen-chao1,SUNYin-qi2,CHENSu-liang2

(1Children’sHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050031,China; 2CenterforDiseaseControlandPreventionofHebeiProvince，Shijiazhuang050021,China)

Objective To typeStreptococcuspneumoniae(S.pneumoniae) isolated from children, and provide scientific basis for the correct selection ofS.pneumoniaevaccine.Methods 182 strains ofS.pneumoniaewere collected from Children’s Hospital of Hebei Province in 2014, species of strains were identified by polymerase chain reaction (PCR), types of strains were analyzed with multiplex PCR.Results PCR detection showed thatcpsAgene amplification of 182 strains were all positive; multiplex PCR detection revealed that except 8 strains were not typed, the main types of the remaining 174 strains were 19 F (n=68, 37.36%), 19A(n=33, 18.13%), and 6A/6B (n=26,14.28%), the other types were 35B, 14, 6C/6D, 23F, 15B/15C, and so on.Conclusion The main types of 182 strains ofS.pneumoniaeare 19 F, 19A, and 6A/6B, which provide scientific basis for the correct selection ofS.pneumoniaevaccine for this province.

Streptococcuspneumoniae; multiplex polymerase chain reaction; bacterial typing; species identification;cpsgene

2016-06-26

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14277733D)

郭映輝(1974-)，女(漢族)，河北省邢臺(tái)市人，主任技師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)研究。

孫印旗 E-mail:hbsunyq@hotmail.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.04.009

R181.3+2 R378.1+2

A

1671-9638(2017)04-0326-04