李先良+趙志常 +高愛平 +陳業(yè)淵 +黃建峰 黨志國 羅睿雄

摘要：花青素還原酶（anthocyanidin reductase，簡稱ANR）基因是植物產(chǎn)生原花青素的關(guān)鍵基因，對于研究原花青素的代謝有重要的作用。根據(jù)已經(jīng)報道的ANR基因的序列設(shè)計兼并引物，采用3′cDNA末端快速擴(kuò)增（3′RACE）、5′cDNA末端快速擴(kuò)增（5′RACE）方法，從芒果果實(shí)內(nèi)克隆到1個ANR基因，其全長cDNA序列為1 201 bp。該基因開放閱讀框?yàn)? 008 bp，編碼335個氨基酸，等電點(diǎn)為5.41，分子量為36.33 ku。對基因組擴(kuò)增得到了1 810 bp長度的片段，分析發(fā)現(xiàn)，該基因含有5個內(nèi)含子，內(nèi)含子位置分別為130～646 bp、733～814 bp、1 017～1 080 bp、1 259～1 349 bp、1 563～1 651 bp。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與可可、葡萄等果樹具有較近的親緣關(guān)系。對不同芒果品種中ANR基因的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因在綠色的桂七品種中表達(dá)量較高，而在紅色的貴妃品種中表達(dá)量較低。

關(guān)鍵詞：芒果；原花青素；花青素還原酶（ANR）；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號：S667.701；Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）04-0022-04

原花青素是苯丙醇代謝途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有消除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、調(diào)解免疫、防止體內(nèi)過氧化等功能。原花青素的抗氧化性能比維生素C高20倍，比維生素E高50倍。此外，原花青素對于水果的口感，以及食草動物對牧草的進(jìn)食量等都有一定的影響[1-4]?；ㄇ嗨剡€原酶（anthocyanidin reductase，簡稱ANR）是原花青素代謝途徑中的關(guān)鍵酶，可催化花青素轉(zhuǎn)化為表兒茶素（2，3-順式黃烷3-醇），進(jìn)一步向液泡中轉(zhuǎn)運(yùn)并聚合成為原花青素。ANR作為花青素代謝途徑上的負(fù)調(diào)控基因，其表達(dá)對花瓣、果實(shí)等組織的呈色有重要的影響[5]。

目前，人們已經(jīng)從擬南芥、銀杏、苦蕎麥、葡萄、蘋果、草莓、百脈根、茶、苜蓿等多種植物中克隆出ANR基因[6-11]。芒果是重要的熱帶、亞熱帶果樹，其果實(shí)色彩多樣，如綠色、黃色、淺黃色、紅色、橙紅色等[12]，其果實(shí)富含類胡蘿卜素、花青素等物質(zhì)。關(guān)于芒果果實(shí)的ANR基因研究未見報道，本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）方法從芒果果實(shí)中克隆得到1個ANR基因，旨在深入探討該基因在芒果果實(shí)花青素合成中的作用機(jī)制及對果實(shí)著色的影響，從而深入揭示該基因在芒果果實(shí)花色形成中的分子機(jī)制，為芒果果實(shí)著色提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以貴妃芒果的果實(shí)為試驗(yàn)材料，取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所的農(nóng)業(yè)部芒果種質(zhì)資源圃。大腸桿菌DH5а，為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。引物由上海英駿生物工程技術(shù)有限公司合成。焦碳酸二乙酯（DEPC）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素（Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）、載體pMD19-T、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1芒果DNA提取參照王家保等方法[13]提取芒果DNA，用無菌雙蒸水溶解，通過核酸蛋白測定儀進(jìn)行純度檢測后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2芒果總RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的總RNA提取試劑盒，從芒果果肉中提取總RNA，用RNase-free無菌水溶解，用寶生物工程（大連）有限公司的DNase試劑盒去除DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和純度，并用核酸蛋白測定儀對所得RNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm及濃度進(jìn)行測定，然后用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。

1.2.3PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；95 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR buffer（含Mg2+）、25 ng DNA模板、20 μmol 引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。反應(yīng)體系在Eppendorf PCR儀上擴(kuò)增后取10 μL上樣電泳，采用GelRed染色后在紫外凝膠成像儀上觀察、拍照分析。

1.2.4ANR基因全長cDNA和基因組DNA序列的獲得以上述反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA為模板，參照該試劑盒的說明書進(jìn)行cDNA 3′端、5′端cDNA的擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增cDNA末端片段的測序結(jié)果，分別設(shè)計2條上游引物，以接頭為錨定引物進(jìn)行半巢式PCR反應(yīng)。將3′端、5′端的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定所得到的片段大小是否與預(yù)測的片段大小一致。對目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序，并根據(jù)已知片段和得到的cDNA 3′端、5′端的序列結(jié)果拼接該基因的全長cDNA。以上述cDNA和提取的基因組DNA為模板，設(shè)計特異引物，進(jìn)行全長cDNA和基因組DNA序列的擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系25 μL，從中取6 μL PCR產(chǎn)物，加入0.2 mL PCR管中，加入1 μL 6×Loading Buffer，用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定擴(kuò)增片段大小是否正確。在確定擴(kuò)增片段大小正確后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit，TaKaRa）回收膠塊中的目的片段，回收方法具體操作參照試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行。取5 μL回收純化后的目的DNA產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳檢測，以檢驗(yàn)回收效果及大致含量，并根據(jù)回收產(chǎn)物片段大小及其有效濃度，取適量回收純化的產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T（TaKaRa）連接，目的DNA與克隆載體的摩爾比控制在3 ∶[KG-*3]1左右。反應(yīng)混合液包括1 μL pMD19-T載體、4 μL純化后的DNA、5 μL連接液（Ligation Solution） I，混合均勻后在16 ℃下恒溫水浴過夜連接。

1.2.5ANR基因氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征和分子進(jìn)化的分析將所擴(kuò)增得到的全長得序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對，確定該基因是否為ANR基因，并進(jìn)行其他物種ANR基因的比對，采用DNAMAN軟件分析基因核苷酸、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和同源性，并分析該基因所對應(yīng)的氨基酸序列，進(jìn)行多序列比較并構(gòu)建系統(tǒng)樹。

1.2.6表達(dá)分析分別提取不同芒果品種的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并采用Primer 5.0設(shè)計引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的擴(kuò)增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列：actin-F，5′-AATGGAAGGAATGGTCAAGGC-3′；actin-R，5′-TGCCAGATTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴(kuò)增采用的引物：ANR-F，5′-GCCAGCATACCATGCACATA-3′；ANR-R，5′-ATACAATGGAGCAACGTAAAT-3′。將PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并采用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出相對表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1ANR基因的獲得

根據(jù)得到的3′、5′端序列信息進(jìn)行拼接，最后得到ANR基因的全長cDNA序列。設(shè)計特異引物，進(jìn)行全長cDNA、基因組DNA序列的擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖1所示。將電泳條帶回收測序后，得到ANR基因的cDNA全長序列為1 201 bp，分析發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框?yàn)? 008 bp，編碼335個氨基酸序列（圖2），其分子量為36.33 ku，等電點(diǎn)為5.41。通過與NCBI上已經(jīng)登錄的蘋果、草莓、荔枝的ANR蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)克隆的基因?yàn)锳NR基因（圖3）。對基因組DNA擴(kuò)增得到約 1 810 bp 的片段，通過與cDNA序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因含有5個內(nèi)含子，堿基位置分別為130～646 bp、733～814 bp、1 017～1 080 bp、1 259～1 349 bp、1 563～1 651 bp（圖4）。

2.2芒果ANR基因的部分生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN進(jìn)行ANR蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)芒果ANR蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件主要以無規(guī)則卷曲、β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖5）。采用 BioEdit 軟件的

Kyte、Doolittle算法對ANR蛋白的親水/疏水性值（正值表示疏水性，負(fù)值表示親水性）進(jìn)行分析表明，ANR蛋白所含氨基酸的親水/疏水性值主要介于-1.8～2.1之間。采用DNAMAN5軟件分析發(fā)現(xiàn)，芒果ANR蛋白與可可、葡萄等果樹的蛋白序列聚為一類；草莓、蘋果、西洋梨、柿和藍(lán)莓等果樹也可以聚為同一類（圖7）。

2.3ANR基因的RT-PCR分析

分別提取不同著色程度芒果的果皮RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：該基因在綠色桂七品種的果實(shí)中表達(dá)量較多，在黃色果皮中次之，而在紅色果皮貴妃中相對表達(dá)量較少（圖8）， 初步推斷ANR基因可能與紅色果實(shí)的原花色素等含

量有一定的關(guān)系。

3討論

ANR基因最初從擬南芥中克隆并命名[14]，ANR基因?qū)ΨN皮色素積累有重要作用，是調(diào)節(jié)種皮色澤的負(fù)調(diào)控基因。該基因在擬南芥突變體的種皮內(nèi)因積累花青素而顯紅色，但類黃酮含量與正常植株含量相差不多[15-17]。通過體外重組ANR能將非手性花青素催化成2，3-順-（2R，3R）-黃烷-3-醇（如表兒茶素）、2，3-反-（2R，3R）-黃烷-3-醇（如內(nèi)兒茶素）[18]。Bogs等對ANR基因在葡萄中的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該基因在葉片、花、果實(shí)中均有表達(dá)，且隨著葉片、花、果實(shí)的生長，原花色素不斷增加，在成熟的果實(shí)中ANR基因表達(dá)量較少，原花色素也不再增加[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，該基因在綠色的桂七芒果品種中表達(dá)量較高，而在紅色的貴妃品種中表達(dá)量較低，這與果皮中花色素的含量呈現(xiàn)相反的趨勢。葡萄ANR基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，表現(xiàn)為表達(dá)量較高的花瓣顏色減弱，花青素含量減少[19]。因此推測，ANR基因的表達(dá)在花青素和原花青素之間的轉(zhuǎn)化中具有重要作用。芒果ANR基因是芒果原花色素合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因之一，它對芒果果皮色澤的影響具有重要作用，而對芒果果實(shí)色澤功能的深入研究須要進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的驗(yàn)證。

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