林軍，張亮，黃先忠

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特色植物基因組學(xué)實驗室，新疆 石河子 832003）

極端溫度、干旱和高鹽堿等不利的環(huán)境條件，會嚴重影響植物的生長發(fā)育，甚至?xí)斐芍参锼劳?。植物面對不利的環(huán)境時，誘導(dǎo)許多抗逆相關(guān)基因表達[1]，而轉(zhuǎn)錄因子在植物基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用——激活或抑制靶基因的表達[2]。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC1/2)轉(zhuǎn)錄因子是近年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有、數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[3]，成員廣泛分布于陸生植物中，其及相應(yīng)的順式作用元件在調(diào)節(jié)基因時間和空間的表達起分子開關(guān)的作用[4]。目前已有較多研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子具有諸多方面的功能，如參與植物次生生長，在細胞分裂和植株衰老中發(fā)揮作用，參與激素調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與礦質(zhì)元素營養(yǎng)和農(nóng)作物品質(zhì)改良等，同時，NAC轉(zhuǎn)錄因子還參與生物脅迫中植物的防御反應(yīng)以及在非生物逆境中發(fā)揮作用。

NAC轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點，蛋白N端含有1個高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，約有150個氨基酸，1共包含了5個保守的亞結(jié)構(gòu)域—A、B、C、D和E[5]。亞域A、C和D高度保守，亞域B和E較為多變，亞域E可能參與發(fā)育時期調(diào)控和（或）組織特異性，并協(xié)同亞域D與DNA發(fā)生相互作用[6-7]，這可能是NAC基于功能多樣性的原因之一。NAC蛋白的C末端區(qū)域是高度多樣化的，并賦予轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控的多樣性。

目前，有研究已證明多個NAC轉(zhuǎn)錄因子涉及植物抗逆過程，在植物非生物逆境中發(fā)揮重要作用。如擬南芥中AtAF1可響應(yīng)干旱脅迫，干旱和脫落酸(ABA)處理后表達量均增加，但會受水淹的抑制[8]；擬南芥NTL8是與膜相連的NAC轉(zhuǎn)錄因子，鹽脅迫誘導(dǎo)下才能生成活性形式，且可通過調(diào)控FT基因的表達在開花期調(diào)節(jié)鹽脅迫[9]；水稻中的OsNAC6受到寒冷、鹽、干旱、ABA、機械損傷、茉莉酸和突發(fā)性疾病的誘導(dǎo)，過表達OsNAC6可誘導(dǎo)許多非生物脅迫相關(guān)基因的表達[10]；擬南芥中 ANAC019、ANAC055和ANAC072均可受干旱、高鹽以及ABA等逆境脅迫誘導(dǎo)表達，且過表達這3個基因均可提高植株的耐旱能力[11]；而小麥中的TaNAC4則可被高鹽、傷害和低溫等條件刺激誘導(dǎo)[12]。

小擬南芥(Arabidopsis pumila)是一種在新疆分布廣泛的十字花科早春短命植物，在《新疆植物志》第三卷中被命名為鼠耳芥，俗稱小擬南芥，Al-Shehbaz于1999年歸其為Olimarabidopsis pumila(無苞芥屬)，因此也可稱其為無苞芥(Olimarabidopsis pumila)。它是擬南芥的近緣種，具有光合速率強、繁殖率高、結(jié)實量大等特點，且有一定表型可塑性，且與擬南芥相比，小擬南芥更為耐受NaCl脅迫[13-14]，這些特點均使得小擬南芥可更好地在新疆特殊的高鹽堿環(huán)境下生存。近年來本實驗室已經(jīng)從小擬南芥克隆了一些抗逆相關(guān)基因，比如OpNHX1[15-16]、OpVP1[17]、OpZFP[18]、OpNAC026、OpNAC083[19-20]以及 OpDBR[21]。據(jù)調(diào)查研究，ApNAC055在擬南芥中的同源基因ANAC055的表達能夠由干旱，高鹽度以及脫落酸誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中的基因表達活性結(jié)果顯示，ANAC055的表達主要定位在葉片中，且轉(zhuǎn)基因植物中幾種脅迫誘導(dǎo)型基因均顯示表達上調(diào)，植株表現(xiàn)出顯著增加的耐旱性，表明ANAC055很可能在擬南芥非生物脅迫響應(yīng)應(yīng)答方面起著重要作用[22]。本研究從小擬南芥中克隆了ApNAC055，對其進行生物信息學(xué)分析以及在鹽脅迫處理下表達模式的分析，以期為該基因后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小擬南芥(Arabidopsis pumila)種子為本實驗室保存。小擬南芥種子滅菌和植株室內(nèi)的培養(yǎng)參照文獻[15]中的方法。

1.2 方法

1.2.1 小擬南芥總RNA提取及cDNA合成

采用的Tiangen公司的RNA prep pure Plant Kit試劑盒提取小擬南芥葉片總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量完好的RNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)說明書，利用北京百泰克公司M-MLV Reverse Transcriptase合成cDNA模板第一鏈。

1.2.2 小擬南芥ApNAC055 CDS區(qū)的克隆與測序

根據(jù)小擬南芥鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)1條Unigene與擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子AtNAC055序列相似性極高，利用DNAStar軟件分析該序列的完整開放閱讀框 (ORF)。根據(jù)該ORF設(shè)計引物ApNAC055-F和ApNAC055-R，在兩端分別加上Xba I和Sma I酶切位點(表1)，以小擬南芥葉片cDNA為模板進行RT-PCR擴增，使用18S rRNA基因作為參照基因，PCR體系參照Ex Taq(TaKaRa)說明書。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 45 s，60 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸1 m，35個循環(huán)后，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(表1)，在紫外燈下切下凝膠中的目的基因條帶，按照凝膠回收試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物的回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行酶切驗證，將鑒定正確的菌液送往北京六合華大基因有限公司進行測序。

表1 研究所用的PCR引物序列Tab.1 PCR primers used in this study

1.2.3 小擬南芥ApNAC055 CDS區(qū)的生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、等電點、疏水性等理化性質(zhì)的分析利用ExPASy網(wǎng)站ProtParam工 具(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)進 行[24]。利用DNAMAN軟件預(yù)測基因的最大開放閱讀框(ORF)及其編碼蛋白的氨基酸序列。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析該蛋白的跨膜區(qū)；蛋白的二級結(jié)構(gòu)利用SOPMA軟件分析，蛋白的三級結(jié)構(gòu)通過Swiss model(http://swissmodel.expasy.org/)軟件預(yù)測。利用NCBI的Blastp程序檢索ApNAC055的同源蛋白，氨基酸序列的多重比對采用Clustal X 2.0程序完成，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其中用Neighbor-Joining方法進行1000次 Boot-strap分析[25]。

1.2.4 小擬南芥ApNAC055的表達分析

將培養(yǎng)2周的小擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至含200 mmol/L NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基上分別處理0、3、6、12、24 和 48 h；收集成熟小擬南芥植株根、莖、葉、花以及果莢。根據(jù)“1.2.2”的方法提取樣品總RNA以及cDNA模板的合成，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)進行基因的組織表達和脅迫表達分析。ApNAC055 ORF引物為ApNAC055-RT-F和ApNAC055-RT-R，組織表達分析選擇轉(zhuǎn)錄起始因子1(Transcription initiation fator，HAF1)作為內(nèi)參引物：HAF1-F和HAF1-R(表1)；鹽脅迫表達分析選擇延伸因子1-α (Elongation fator 1-alpha，EF1-α)作為內(nèi)參引物：EF1-α-F和 EF1-α-R(表 1)。qRT-PCR采用Fast SYBR Mixture試劑盒(康為世紀)，利用美國ABI7500Fast實時熒光定量PCR儀(Life Technologies，F(xiàn)oster City，CA，USA) 進行擴增。在 10 μL的反應(yīng)體系中加入 cDNA模板 2μL，Ultra SYBR Mixture 5 μL，ROX 0.2 μL，正反向引物(10 μmol/L)各 0.2 μL，RNase-Free Water 補齊。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)，60℃讀取熒光值。檢測每份樣品的目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，每份樣品3次PCR重復(fù)。實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析[17]，分別將根和鹽脅迫處理0 h的mRNA水平設(shè)定為標(biāo)準值1，使用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小擬南芥ApNAC055 CDS區(qū)的克隆與分析

為了獲得新疆小擬南芥的ApNAC055基因的ORF，以葉片cDNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)擴增出了該基因的CDS，產(chǎn)物大小約為1000 bp(圖1)。測序結(jié)果結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，表明ApNAC055全長為1246 bp，ORF實際大小為 954 bp，推測編碼 317個氨基酸(圖 2)。

圖1 ApNAC055基因的擴增Fig.1 Amplification of ApNAC055

圖2 ApNAC055核苷酸序列及推測氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of ApNAC055 and the deduced amino acid sequence

2.2 ApNAC055CDS區(qū)的生物信息學(xué)分析

ApNAC055編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，該蛋白的分子式為C1583H2415N443O475S6，分子量35444.63 Da，等電點為8.86，屬于穩(wěn)定蛋白。親疏水性預(yù)測表明，總平均親水性為-0.632，親水性越強氨基酸分值越低，疏水性越強分值越高，因此，小擬南芥ApNAC055是親水性蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明ApNAC055蛋白無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，因此ApNAC055可能不是膜蛋白。

利用NCBI網(wǎng)站保守結(jié)構(gòu)域分析工具(Conserved domain database，CDD)對ApNAC055蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，ApNAC055屬于NAM亞家族，具有典型的NAM結(jié)構(gòu)(圖3)。其中NAC域位于第14到第162個氨基酸，包含1個DNA結(jié)合域和1個二聚化域，DNA結(jié)合域處于滴102位氨基酸到168位氨基酸。亞細胞定位預(yù)測其為細胞核定位。

SPOMA預(yù)測的ApNAC055蛋白二級結(jié)構(gòu) (圖4)表明共有α-螺旋(Alpha helix)73處，占二級結(jié)構(gòu)的23.03%；延伸鏈(Extended strand)64處，占二級結(jié)構(gòu)的20.19%，β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)33處，占二級結(jié)構(gòu)的10.41%；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil)147處，占二級結(jié)構(gòu)的46.37%。Swiss-model同源建模軟件分析其對應(yīng)的三級結(jié)構(gòu)(圖5)，結(jié)果表明該蛋白與擬南芥的三級結(jié)構(gòu)相似性為94.05%。

圖3 ApNAC055蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 The conserved domain of ApNAC055 protein

圖4 ApNAC055蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of ApNAC055

圖5 ApNAC055蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Third structure prediction of ApNAC055

利用Blastp檢索ApNAC055的同源蛋白，選取其它5個物種的NAC055蛋白氨基酸序列，包括擬南芥 (Arabidopsis thaliana，NP_188169.1)、琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata，XP_002882947.1)、亞麻芥(Camelinasativa，XP_010487376.1)、蘿 卜 (Raphanussativus，XP_018486947.1)和歐洲油菜(Brassica napus，NP_001303168.1)。經(jīng) Clusta lX 2.0 比對(圖 6)發(fā)現(xiàn)，NAC 蛋白N端均存在1段約150個氨基酸殘基組成的保守域，即NAC結(jié)構(gòu)域，其存在5個亞結(jié)構(gòu)域—A、B、C、D和E，我們可以發(fā)現(xiàn)它們是極度保守的，一致性很高；而蛋白C端則很明顯開始出現(xiàn)多樣化，并且小擬南芥、擬南芥以及琴葉擬南芥三者與蘿卜和歐洲油菜NAC055相比，在第278個氨基酸開始，出現(xiàn)了約15個氨基酸片段的缺失，很有可能造成NAC055基因在前三者與蘿卜以及歐洲油菜中功能出現(xiàn)差異。

圖6 小擬南芥ApNAC055同其他物種NAC055蛋白氨基酸序列的多重比對Fig.6 Amino acid alignment of ApNAC055 with other NAC055 from different plant species

2.3 ApNAC055蛋白的系統(tǒng)進化分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索ApNAC055的同源蛋白序列，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建了小擬南芥(Arabidopsis pumila)ApNAC055與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、亞麻芥(Camelinasatinus)、 薺 菜 (Capsellarubella)、 蕪 菁(Brassica rapa)、歐洲油菜(Brassica napus)以及甜橙(Citrus sinensis)中NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白的系統(tǒng)進化樹(圖 7)。結(jié)果(圖 7)表明，ApNAC055 與芥屬的 NAC055蛋白進化關(guān)系均較近，與蕪菁BrNAC055的親緣關(guān)系最近，屬于同一進化分支，與甜橙CsNAC055親緣關(guān)系較遠。

圖7 ApNAC55與其他植物NAC家族轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進化分析Fig.7 Phylogenetic tree of ApNAC055 and other NAC family transcription factor proteins from other plant species based on amino acid sequences

2.4 基因的組織表達分析與脅迫表達分析

qRT-PCR實驗結(jié)果(圖8)表明，ApNAC055在小擬南芥各組織中均有表達，但在花和果莢中的表達量最高，尤其是在果莢中。鹽脅迫表達分析結(jié)果(圖9)顯示ApNAC055積極響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答，并在后續(xù)時段中持續(xù)保持高表達水平。

圖8 小擬南芥ApNAC055組織表達情況Fig.8 Expression patterns of ApNAC055 in different tissues ofArabidopsis pumila

圖9 200 mmol/L NaCl處理下小擬南芥幼苗ApNAC055的表達情況Fig.9 Expression patterns of ApNAC055 under 200 mmol/L NaCl stress inArabidopsis pumilaseedlings

3 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫應(yīng)答過程中起著重要作用，但目前對其分子機制還不明確，因此分析其功能機制十分重要。本研究以小擬南芥ApNAC055為研究對象，利用了高鹽脅迫小擬南芥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從小擬南芥葉片cDNA中克隆了該基因CDS區(qū)。ApNAC055蛋白在N端存在1個NAM保守域，保守域上存在5個亞結(jié)構(gòu)域，而在蛋白C端結(jié)構(gòu)較為不保守，其結(jié)構(gòu)表明ApNAC055很可能在功能上存在著多樣性。

基因表達模式的分析對于功能研究是必不可少的，組織表達分析表明ApNAC055在小擬南芥各組織中表達幅度較大，主要在葉片和果莢中表達量較高，尤其是在果莢中，表達量幾近達到根、莖和葉中的20倍，說明ApNAC055很可能參與到小擬南芥花器官和(或)種子的形成和發(fā)育的過程；本研究使用200mmol/LNaCl脅迫處理表達分析結(jié)果顯示ApNAC055能夠明顯且快速地被誘導(dǎo)表達，且持續(xù)保持著較高的表達水平，表明ApNAC055很可能參與小擬南芥鹽脅迫響應(yīng)。

已有研究表明，擬南芥AtNAC055基因在擬南芥耐旱過程起著重要作用，過表達AtNAC055植株存在著較強的抗旱性，并且能夠被ABA、鹽和干旱顯著誘導(dǎo)表達[26]。本研究也證實了在小擬南芥中ApNAC055基因很可能參與鹽脅迫響應(yīng)應(yīng)答。對于在小擬南芥其他非生物脅迫響應(yīng)過程中是否發(fā)揮作用的深入研究將是今后要展開的工作，以進一步研究ApNAC055的生物學(xué)功能。

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