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        新疆小擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子ApNAC055的克隆及表達分析

        2017-05-07 02:59:41林軍張亮黃先忠
        關(guān)鍵詞:擬南芥結(jié)構(gòu)域克隆

        林軍,張亮,黃先忠

        (石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特色植物基因組學(xué)實驗室,新疆 石河子 832003)

        極端溫度、干旱和高鹽堿等不利的環(huán)境條件,會嚴重影響植物的生長發(fā)育,甚至?xí)斐芍参锼劳?。植物面對不利的環(huán)境時,誘導(dǎo)許多抗逆相關(guān)基因表達[1],而轉(zhuǎn)錄因子在植物基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用——激活或抑制靶基因的表達[2]。NAC(NAM、ATAF1/2、CUC1/2)轉(zhuǎn)錄因子是近年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有、數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[3],成員廣泛分布于陸生植物中,其及相應(yīng)的順式作用元件在調(diào)節(jié)基因時間和空間的表達起分子開關(guān)的作用[4]。目前已有較多研究表明,NAC轉(zhuǎn)錄因子具有諸多方面的功能,如參與植物次生生長,在細胞分裂和植株衰老中發(fā)揮作用,參與激素調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),參與礦質(zhì)元素營養(yǎng)和農(nóng)作物品質(zhì)改良等,同時,NAC轉(zhuǎn)錄因子還參與生物脅迫中植物的防御反應(yīng)以及在非生物逆境中發(fā)揮作用。

        NAC轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點,蛋白N端含有1個高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域,約有150個氨基酸,1共包含了5個保守的亞結(jié)構(gòu)域—A、B、C、D和E[5]。亞域A、C和D高度保守,亞域B和E較為多變,亞域E可能參與發(fā)育時期調(diào)控和(或)組織特異性,并協(xié)同亞域D與DNA發(fā)生相互作用[6-7],這可能是NAC基于功能多樣性的原因之一。NAC蛋白的C末端區(qū)域是高度多樣化的,并賦予轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控的多樣性。

        目前,有研究已證明多個NAC轉(zhuǎn)錄因子涉及植物抗逆過程,在植物非生物逆境中發(fā)揮重要作用。如擬南芥中AtAF1可響應(yīng)干旱脅迫,干旱和脫落酸(ABA)處理后表達量均增加,但會受水淹的抑制[8];擬南芥NTL8是與膜相連的NAC轉(zhuǎn)錄因子,鹽脅迫誘導(dǎo)下才能生成活性形式,且可通過調(diào)控FT基因的表達在開花期調(diào)節(jié)鹽脅迫[9];水稻中的OsNAC6受到寒冷、鹽、干旱、ABA、機械損傷、茉莉酸和突發(fā)性疾病的誘導(dǎo),過表達OsNAC6可誘導(dǎo)許多非生物脅迫相關(guān)基因的表達[10];擬南芥中 ANAC019、ANAC055和ANAC072均可受干旱、高鹽以及ABA等逆境脅迫誘導(dǎo)表達,且過表達這3個基因均可提高植株的耐旱能力[11];而小麥中的TaNAC4則可被高鹽、傷害和低溫等條件刺激誘導(dǎo)[12]。

        小擬南芥(Arabidopsis pumila)是一種在新疆分布廣泛的十字花科早春短命植物,在《新疆植物志》第三卷中被命名為鼠耳芥,俗稱小擬南芥,Al-Shehbaz于1999年歸其為Olimarabidopsis pumila(無苞芥屬),因此也可稱其為無苞芥(Olimarabidopsis pumila)。它是擬南芥的近緣種,具有光合速率強、繁殖率高、結(jié)實量大等特點,且有一定表型可塑性,且與擬南芥相比,小擬南芥更為耐受NaCl脅迫[13-14],這些特點均使得小擬南芥可更好地在新疆特殊的高鹽堿環(huán)境下生存。近年來本實驗室已經(jīng)從小擬南芥克隆了一些抗逆相關(guān)基因,比如OpNHX1[15-16]、OpVP1[17]、OpZFP[18]、OpNAC026、OpNAC083[19-20]以及 OpDBR[21]。據(jù)調(diào)查研究,ApNAC055在擬南芥中的同源基因ANAC055的表達能夠由干旱,高鹽度以及脫落酸誘導(dǎo),轉(zhuǎn)基因擬南芥中的基因表達活性結(jié)果顯示,ANAC055的表達主要定位在葉片中,且轉(zhuǎn)基因植物中幾種脅迫誘導(dǎo)型基因均顯示表達上調(diào),植株表現(xiàn)出顯著增加的耐旱性,表明ANAC055很可能在擬南芥非生物脅迫響應(yīng)應(yīng)答方面起著重要作用[22]。本研究從小擬南芥中克隆了ApNAC055,對其進行生物信息學(xué)分析以及在鹽脅迫處理下表達模式的分析,以期為該基因后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        小擬南芥(Arabidopsis pumila)種子為本實驗室保存。小擬南芥種子滅菌和植株室內(nèi)的培養(yǎng)參照文獻[15]中的方法。

        1.2 方法

        1.2.1 小擬南芥總RNA提取及cDNA合成

        采用的Tiangen公司的RNA prep pure Plant Kit試劑盒提取小擬南芥葉片總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量完好的RNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩8鶕?jù)說明書,利用北京百泰克公司M-MLV Reverse Transcriptase合成cDNA模板第一鏈。

        1.2.2 小擬南芥ApNAC055 CDS區(qū)的克隆與測序

        根據(jù)小擬南芥鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)1條Unigene與擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子AtNAC055序列相似性極高,利用DNAStar軟件分析該序列的完整開放閱讀框 (ORF)。根據(jù)該ORF設(shè)計引物ApNAC055-F和ApNAC055-R,在兩端分別加上Xba I和Sma I酶切位點(表1),以小擬南芥葉片cDNA為模板進行RT-PCR擴增,使用18S rRNA基因作為參照基因,PCR體系參照Ex Taq(TaKaRa)說明書。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4 min,94℃變性 45 s,60 ℃ 退火45 s,72 ℃延伸1 m,35個循環(huán)后,72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(表1),在紫外燈下切下凝膠中的目的基因條帶,按照凝膠回收試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物的回收,連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,提取質(zhì)粒進行酶切驗證,將鑒定正確的菌液送往北京六合華大基因有限公司進行測序。

        表1 研究所用的PCR引物序列Tab.1 PCR primers used in this study

        1.2.3 小擬南芥ApNAC055 CDS區(qū)的生物信息學(xué)分析

        蛋白質(zhì)氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、等電點、疏水性等理化性質(zhì)的分析利用ExPASy網(wǎng)站ProtParam工 具(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)進 行[24]。利用DNAMAN軟件預(yù)測基因的最大開放閱讀框(ORF)及其編碼蛋白的氨基酸序列。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析該蛋白的跨膜區(qū);蛋白的二級結(jié)構(gòu)利用SOPMA軟件分析,蛋白的三級結(jié)構(gòu)通過Swiss model(http://swissmodel.expasy.org/)軟件預(yù)測。利用NCBI的Blastp程序檢索ApNAC055的同源蛋白,氨基酸序列的多重比對采用Clustal X 2.0程序完成,用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,其中用Neighbor-Joining方法進行1000次 Boot-strap分析[25]。

        1.2.4 小擬南芥ApNAC055的表達分析

        將培養(yǎng)2周的小擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至含200 mmol/L NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基上分別處理0、3、6、12、24 和 48 h;收集成熟小擬南芥植株根、莖、葉、花以及果莢。根據(jù)“1.2.2”的方法提取樣品總RNA以及cDNA模板的合成,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)進行基因的組織表達和脅迫表達分析。ApNAC055 ORF引物為ApNAC055-RT-F和ApNAC055-RT-R,組織表達分析選擇轉(zhuǎn)錄起始因子1(Transcription initiation fator,HAF1)作為內(nèi)參引物:HAF1-F和HAF1-R(表1);鹽脅迫表達分析選擇延伸因子1-α (Elongation fator 1-alpha,EF1-α)作為內(nèi)參引物:EF1-α-F和 EF1-α-R(表 1)。qRT-PCR采用Fast SYBR Mixture試劑盒(康為世紀),利用美國ABI7500Fast實時熒光定量PCR儀(Life Technologies,F(xiàn)oster City,CA,USA) 進行擴增。在 10 μL的反應(yīng)體系中加入 cDNA模板 2μL,Ultra SYBR Mixture 5 μL,ROX 0.2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各 0.2 μL,RNase-Free Water 補齊。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性 10 min,95℃變性 15 s,60℃退火1 min,40個循環(huán),60℃讀取熒光值。檢測每份樣品的目的基因和內(nèi)參基因的Ct值,每份樣品3次PCR重復(fù)。實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析[17],分別將根和鹽脅迫處理0 h的mRNA水平設(shè)定為標(biāo)準值1,使用Microsoft Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 小擬南芥ApNAC055 CDS區(qū)的克隆與分析

        為了獲得新疆小擬南芥的ApNAC055基因的ORF,以葉片cDNA為模板,通過RT-PCR技術(shù)擴增出了該基因的CDS,產(chǎn)物大小約為1000 bp(圖1)。測序結(jié)果結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),表明ApNAC055全長為1246 bp,ORF實際大小為 954 bp,推測編碼 317個氨基酸(圖 2)。

        圖1 ApNAC055基因的擴增Fig.1 Amplification of ApNAC055

        圖2 ApNAC055核苷酸序列及推測氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of ApNAC055 and the deduced amino acid sequence

        2.2 ApNAC055CDS區(qū)的生物信息學(xué)分析

        ApNAC055編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明,該蛋白的分子式為C1583H2415N443O475S6,分子量35444.63 Da,等電點為8.86,屬于穩(wěn)定蛋白。親疏水性預(yù)測表明,總平均親水性為-0.632,親水性越強氨基酸分值越低,疏水性越強分值越高,因此,小擬南芥ApNAC055是親水性蛋白??缒そY(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明ApNAC055蛋白無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域,因此ApNAC055可能不是膜蛋白。

        利用NCBI網(wǎng)站保守結(jié)構(gòu)域分析工具(Conserved domain database,CDD)對ApNAC055蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果表明,ApNAC055屬于NAM亞家族,具有典型的NAM結(jié)構(gòu)(圖3)。其中NAC域位于第14到第162個氨基酸,包含1個DNA結(jié)合域和1個二聚化域,DNA結(jié)合域處于滴102位氨基酸到168位氨基酸。亞細胞定位預(yù)測其為細胞核定位。

        SPOMA預(yù)測的ApNAC055蛋白二級結(jié)構(gòu) (圖4)表明共有α-螺旋(Alpha helix)73處,占二級結(jié)構(gòu)的23.03%;延伸鏈(Extended strand)64處,占二級結(jié)構(gòu)的20.19%,β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)33處,占二級結(jié)構(gòu)的10.41%;無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil)147處,占二級結(jié)構(gòu)的46.37%。Swiss-model同源建模軟件分析其對應(yīng)的三級結(jié)構(gòu)(圖5),結(jié)果表明該蛋白與擬南芥的三級結(jié)構(gòu)相似性為94.05%。

        圖3 ApNAC055蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 The conserved domain of ApNAC055 protein

        圖4 ApNAC055蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of ApNAC055

        圖5 ApNAC055蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Third structure prediction of ApNAC055

        利用Blastp檢索ApNAC055的同源蛋白,選取其它5個物種的NAC055蛋白氨基酸序列,包括擬南芥 (Arabidopsis thaliana,NP_188169.1)、琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata,XP_002882947.1)、亞麻芥(Camelinasativa,XP_010487376.1)、蘿 卜 (Raphanussativus,XP_018486947.1)和歐洲油菜(Brassica napus,NP_001303168.1)。經(jīng) Clusta lX 2.0 比對(圖 6)發(fā)現(xiàn),NAC 蛋白N端均存在1段約150個氨基酸殘基組成的保守域,即NAC結(jié)構(gòu)域,其存在5個亞結(jié)構(gòu)域—A、B、C、D和E,我們可以發(fā)現(xiàn)它們是極度保守的,一致性很高;而蛋白C端則很明顯開始出現(xiàn)多樣化,并且小擬南芥、擬南芥以及琴葉擬南芥三者與蘿卜和歐洲油菜NAC055相比,在第278個氨基酸開始,出現(xiàn)了約15個氨基酸片段的缺失,很有可能造成NAC055基因在前三者與蘿卜以及歐洲油菜中功能出現(xiàn)差異。

        圖6 小擬南芥ApNAC055同其他物種NAC055蛋白氨基酸序列的多重比對Fig.6 Amino acid alignment of ApNAC055 with other NAC055 from different plant species

        2.3 ApNAC055蛋白的系統(tǒng)進化分析

        通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索ApNAC055的同源蛋白序列,利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建了小擬南芥(Arabidopsis pumila)ApNAC055與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、琴葉擬南芥 (Arabidopsis lyrata)、亞麻芥(Camelinasatinus)、 薺 菜 (Capsellarubella)、 蕪 菁(Brassica rapa)、歐洲油菜(Brassica napus)以及甜橙(Citrus sinensis)中NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白的系統(tǒng)進化樹(圖 7)。結(jié)果(圖 7)表明,ApNAC055 與芥屬的 NAC055蛋白進化關(guān)系均較近,與蕪菁BrNAC055的親緣關(guān)系最近,屬于同一進化分支,與甜橙CsNAC055親緣關(guān)系較遠。

        圖7 ApNAC55與其他植物NAC家族轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進化分析Fig.7 Phylogenetic tree of ApNAC055 and other NAC family transcription factor proteins from other plant species based on amino acid sequences

        2.4 基因的組織表達分析與脅迫表達分析

        qRT-PCR實驗結(jié)果(圖8)表明,ApNAC055在小擬南芥各組織中均有表達,但在花和果莢中的表達量最高,尤其是在果莢中。鹽脅迫表達分析結(jié)果(圖9)顯示ApNAC055積極響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答,并在后續(xù)時段中持續(xù)保持高表達水平。

        圖8 小擬南芥ApNAC055組織表達情況Fig.8 Expression patterns of ApNAC055 in different tissues ofArabidopsis pumila

        圖9 200 mmol/L NaCl處理下小擬南芥幼苗ApNAC055的表達情況Fig.9 Expression patterns of ApNAC055 under 200 mmol/L NaCl stress inArabidopsis pumilaseedlings

        3 討論

        NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫應(yīng)答過程中起著重要作用,但目前對其分子機制還不明確,因此分析其功能機制十分重要。本研究以小擬南芥ApNAC055為研究對象,利用了高鹽脅迫小擬南芥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從小擬南芥葉片cDNA中克隆了該基因CDS區(qū)。ApNAC055蛋白在N端存在1個NAM保守域,保守域上存在5個亞結(jié)構(gòu)域,而在蛋白C端結(jié)構(gòu)較為不保守,其結(jié)構(gòu)表明ApNAC055很可能在功能上存在著多樣性。

        基因表達模式的分析對于功能研究是必不可少的,組織表達分析表明ApNAC055在小擬南芥各組織中表達幅度較大,主要在葉片和果莢中表達量較高,尤其是在果莢中,表達量幾近達到根、莖和葉中的20倍,說明ApNAC055很可能參與到小擬南芥花器官和(或)種子的形成和發(fā)育的過程;本研究使用200mmol/LNaCl脅迫處理表達分析結(jié)果顯示ApNAC055能夠明顯且快速地被誘導(dǎo)表達,且持續(xù)保持著較高的表達水平,表明ApNAC055很可能參與小擬南芥鹽脅迫響應(yīng)。

        已有研究表明,擬南芥AtNAC055基因在擬南芥耐旱過程起著重要作用,過表達AtNAC055植株存在著較強的抗旱性,并且能夠被ABA、鹽和干旱顯著誘導(dǎo)表達[26]。本研究也證實了在小擬南芥中ApNAC055基因很可能參與鹽脅迫響應(yīng)應(yīng)答。對于在小擬南芥其他非生物脅迫響應(yīng)過程中是否發(fā)揮作用的深入研究將是今后要展開的工作,以進一步研究ApNAC055的生物學(xué)功能。

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