者湘漪 ，朱君玲 ，姜心雨 ，何鴻昌 ，潘貞貞 ,4，蔣琦偉 ，王媛 ，李洪濤 ，鄭威楠 ，潘澤民 *

（1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，新疆 石河子 832002；2喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院病理科，新疆 喀什 844000；3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，新疆 石河子 832002；4新疆兵團(tuán)第四師醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 伊犁 835000）

宮頸癌在婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤中位居第三位，僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌。2012年全球?qū)m頸癌新確診 527，624例，死亡 265，653例[1]。我國(guó)宮頸癌患病率高，尤其在新疆維吾爾族婦女中，宮頸癌的發(fā)病率高達(dá)527/100000[2]。宮頸癌的發(fā)生涉及諸多因素，其中持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒HPV16，已被公認(rèn)為是引起宮頸癌，以及發(fā)展成為侵潤(rùn)性宮頸癌最主要的因素[3]。

宮頸癌的發(fā)展和進(jìn)展涉及多種因素，大多數(shù)HPV16感染會(huì)在感染后一到兩年內(nèi)自動(dòng)被免疫系統(tǒng)清除，只有一小部分HPV病毒感染發(fā)展成為宮頸癌[4-6]。HPV16作為宮頸癌最常見(jiàn)的高危型人乳頭瘤病毒，促使發(fā)展成為宮頸癌的因素還不清楚。

基于HPV16E6基因區(qū)域單核苷酸多態(tài)性(SNPs)系統(tǒng)發(fā)育模式，可將HPV16定義為6個(gè)亞型：歐洲型(E)，亞洲型(As)，非洲 1 型（Af1），非洲 2 型（Af2），亞洲美洲型(AA)和北美型(NA)[7]。HPV16 譜系有地理區(qū)域集中分布現(xiàn)象，以及民族性差別。不同的HPV16亞型具有不同的致癌潛能，可能與某些重要序列位點(diǎn)突變有關(guān)[8-11]。然而，新疆維吾爾族宮頸癌HPV16亞型還鮮為人知。

人乳頭瘤病毒HPV16 E6，E7基因編碼的癌蛋白在HPV16介導(dǎo)的宮頸癌過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，并且涉及多個(gè)信號(hào)通路[12]。已有研究表明，HPV16 E6，E7基因是研究HPV16疫苗很有前景的靶基因[13-14]。E6，E7基因多個(gè)位點(diǎn)突變影響HPV16病毒的抗原性，免疫原性以及易感性[5-6]。多項(xiàng)研究表明，非歐洲型的（non-European）病毒感染相比于歐洲型HPV16感染，更容易進(jìn)展為高度鱗狀上皮病變(HSIL)[15]。

本研究通過(guò)分析維吾爾族婦女宮頸癌HPV16病毒 E6，E7基因核苷酸序列，研究本地區(qū)HPV16亞型突變情況和分布特點(diǎn)，探討HPV16E6，E7基因突變與新疆地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌高發(fā)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 標(biāo)本采集

采集喀什人民醫(yī)院和烏魯木齊自治區(qū)人民醫(yī)院2011-2014年維吾爾族婦女宮頸鱗癌手術(shù)或活檢樣本（經(jīng)病理檢測(cè)確定為宮頸鱗癌），用HPV16 E6引物篩選出43例感染HPV16病毒的宮頸鱗癌樣本。其中，20例為新疆南部維吾爾族婦女，23例為新疆北部維吾爾族婦女，患者均無(wú)外地長(zhǎng)期居住史。樣本于-80℃凍存。

1.2 DNA制備和HPV16病毒鑒定

DNA提取采用SK1252基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。設(shè)計(jì)HPV16 E6引物，用PCR方法對(duì)樣本進(jìn)行HPV16病毒檢測(cè)。鑒定HPV16 E6引物序列 HPV16E6-F：5’-GACCCAGAAAGTTACCACAG-3’，HPV16 E6-R：5′-CACAACGGTTTGTTGTATTG-3′（F：正向引物；R：反向引物）。

1.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

HPV16 E6，E7基因片段通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系50 μL包含上下游引物各20 pmoles，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，0.1%TritonX-100，50 μmmol/L dNTP，1.8 U HotStar Taq polymerase和5 μL DNA模版。PCR反應(yīng)條件均為：94℃ 5 min;30個(gè)循環(huán) 55℃ 45 s，72℃60 s，94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s；72 ℃ 5 min。測(cè)序引物見(jiàn)表1。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

1.4 HPV16變異株進(jìn)化學(xué)分析

PCR產(chǎn)物用SAP (Promega)和Exo I(Epicentre)進(jìn)行純化后，通過(guò)ABI Big-DyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit DNA分析儀(ABI3130XL，上海天昊生物醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行測(cè)序，用Polyphred軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析，以及和HPV16歐洲標(biāo)準(zhǔn)株 (GenBank:NC_001526.2)以及其它典型的HPV16變異株進(jìn)行比較 (GenBank:AF472508;HQ644238)，AA (GenBank:AF402678) 和AA1(GenBank:HQ644247)。進(jìn)化樹(shù)通過(guò)軟件MEGA 6構(gòu)建（圖 1）。

圖1 HPV16 E6進(jìn)化學(xué)分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of HPV16 E6 gene

1.5 GenBank登錄號(hào)

本研究 HPV16 E6，E7基因測(cè)序序列在網(wǎng)站NCBIGenBank的登錄號(hào)分別為E6:KT959524-KT959566，E7:KT966608-KT966650。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E6和E7基因的突變分析

43例患者全長(zhǎng)的HPV16 E6，E7基因完成測(cè)序后序列與歐洲標(biāo)準(zhǔn)株相比較，基因變異位點(diǎn)（表2）。

表2 HPV16 E6,E7基因變異位點(diǎn)Tab.2 Nucleotide sequence variations in HPV16 of E6,E7

在E6，E7的測(cè)序結(jié)果中，共發(fā)現(xiàn)6個(gè)突變位點(diǎn)，4個(gè)為錯(cuò)義突變位點(diǎn)，2個(gè)為無(wú)義突變位點(diǎn)，分布在 E6基因的錯(cuò)義突變位點(diǎn)分別為T178G，T295G，T350G，A647G 位于E7基因，引起氨基酸改變分別為天冬氨酸→谷氨酸(D25E)，天冬氨酸→谷氨酸(D64E)，亮氨酸→纈氨酸(L83V)，天冬酰胺→絲氨酸(N29S)。兩個(gè)無(wú)義突變均在E6基因，分別為nt 131，A →C，nt 96，G→A。HPV16 E6 最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是 T350G(34/43，79.1%)和 T295G(6/43，14.0%)。其中，T295G為一個(gè)新的突變位點(diǎn)，從未見(jiàn)報(bào)道。值得注意的是，6例T295G樣本均存在T350G突變。與E6相比較，E7基因更保守，僅在一例樣本的測(cè)序中發(fā)現(xiàn)A131C，T178G和A647G。

2.2 HPV16E6和E7的核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)分析

E6進(jìn)化學(xué)分析表明（圖1），43例樣本當(dāng)中，只有XJ-5屬于亞洲株，其余屬于歐洲株，其中，有6例獨(dú)立成一個(gè)分支，這與E6 T295G突變有關(guān)。E7進(jìn)化學(xué)分析結(jié)果與E6的結(jié)果一致，只有XJ-5屬于亞洲株，其余均為歐洲株（圖2）。

圖2 HPV16 E7進(jìn)化學(xué)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HPV16 E7 gene

3 討論

流行病學(xué)資料表明，相同的HPV類型的不同突變型具有生物學(xué)差異，可能會(huì)導(dǎo)致不同的致病風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，了解地區(qū)的HPV16變體的序列特征具有重要意義。多個(gè)研究報(bào)道，HPV16亞型在中國(guó)漢族女性中的分布高度相似，大多數(shù)為HPV16亞洲和歐洲型亞型[9，16-18]。但是，在維吾爾族婦女中HPV16亞型的分布還不清楚。我們的研究表明，新疆HPV16亞型最為普遍是歐洲株。相比之下，亞洲株普遍存在中國(guó)的其他地區(qū)，我們的結(jié)果沒(méi)有觀察到美洲-亞洲，中美洲，非洲亞型，維吾爾族婦女中亞洲株較少，這可能是因?yàn)榫S吾爾人的種族特征有關(guān)。結(jié)果提示，新疆維吾爾族婦女浸潤(rùn)性宮頸癌的感染和發(fā)展可能和歐洲株有關(guān)。43例樣本包括HPV16歐洲原始株350T 8 例（8/43，18.6%），HPV16歐洲變異株 350G（L83V）34例（34/43，79.1%），亞洲變異株 1例（1/43，2.3%）。研究表明，HPV16 E6 L83V變種在摩洛哥婦女高度宮頸損傷中普遍存在，并且與宮頸癌的進(jìn)展密切相關(guān)[19];該變體比HPV16歐洲原始株E6350T在宮頸疾病持續(xù)感染HPV16的婦女中以及宮頸癌的惡性進(jìn)展中更為普遍[20-21]。此外，我們?cè)贖PV16歐洲株當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了6例新的核苷酸變異HPV16 E6T295G，以及350G共突變。我們的研究結(jié)果提示，T350G-T295G可能可以作為是HPV16歐洲變異株新疆變種對(duì)中國(guó)新疆HPV16變異型進(jìn)行劃分。

研究表明，E7與E6相比更保守[22-23]。我們發(fā)現(xiàn)只有一例A647G（N29S）突變，這是一個(gè)熱點(diǎn)突變點(diǎn)，在亞洲女性中很常見(jiàn)。研究顯示，韓國(guó)婦女宮頸癌中常見(jiàn)E7 N29S，并且增加了患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)[17，24]。

我們的研究結(jié)果顯示，在新疆維吾爾族婦女宮頸癌中HPV16歐洲變異株是最常見(jiàn)的類型，明顯不同來(lái)自中國(guó)其他地方。未來(lái)的研究在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上結(jié)合細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究HPV16變體在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

[1] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence and mortality worldwide:Sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer，2015，136（5）:359-386.

[2] Zheng X Z，Yang A Q，Pan X L，et al.Ethnicity determines association of p53Arg72Pro alleles with cervical cancer in China.European journalofcancer prevention[J].Eur J Cancer Prev，2008，17（5）:460-466.

[3] Almajhdi F N，Senger T，Amer H M ，et al.Design of a highly effective therapeutic HPV16 E6/E7-specific DNA vaccine:optimization by different ways of sequence rearrangements(shuffling)[J].PloS one,2014，9（11）:113461.

[4] Bernard H U，Calleja-Macias I E，Dunn S T.Genome variation of human papillomavirus types:phylogenetic and medical implications[J].Int J Cancer,2006，118（5）:1071-1076.

[5] Zuna R E，Tuller E，Wentzensen N，et al.HPV16 variant lineage，clinical stage，and survival in women with invasive cervical cancer[J].Int J Cancer.2011，6:19.

[6] Freitas L B，Chen Z，Muqui E F，et al.Human papillomavirus 16 non-European variants are preferentially associated with highgrade cervical lesions.PloS one.2014，9（7）:100746.

[7] Yamada T，Wheeler C M，Halpern A L，et al.Human papillomavirus type 16 variant lineages in United States populations characterized by nucleotide sequence analysis of the E6，L2，and L1 coding segments[J].J Virol.1995，69(12):7743-7753.

[8] Cornet I，Gheit T，Iannacone M R，et al.HPV16 genetic variation and the development of cervical cancer worldwide[J].Br J Cancer.2013，108(1):240-244.

[9] Chan P K，Lam C W，Cheung T H，et al.Human papillomavirus type 16 intratypic variant infection and risk for cervical neoplasia in southern China[J].J Infect Dis,2002，186(5):696-700.

[10] Chang Y J，Chen H C，Pan M H，et al.Intratypic variants of human papillomavirus type 16 and risk of cervical neoplasia in Taiwan[J].J Med Virol,2013，85(9):1567-1576.

[11]Zehbe I，Voglino G，Delius H，et al.Risk of cervical cancer and geographical variations of human papillomavirus 16 E6 polymorphisms[J].Lancet,1998，352(9138):1441-1442.

[12]Moody C A，Laimins L A.Human papillomavirus oncoproteins:pathways to transformation[J].Nature Reviews Cancer，2010，10(8):550-560.

[13] Lee D W，Anderson M E，Wu S，et al.Development of an adenoviral vaccine against E6 and E7 oncoproteins to prevent growth of human papillomavirus–positive cancer[J].Archives of Otolaryngology– Head& Neck Surgery，2008，134(12):1316-1323.

[14] Li Y L，Qiu X H，Shen C，et al.Vaccination of full-length HPV16 E6 or E7 protein inhibits the growth of HPV16 associated tumors[J].Oncology Reports，2010，24(5):1323-1329.

[15] Sichero L，F(xiàn)erreira S，Trottier H，et al.High grade cervical lesions are caused preferentially by non-European variants of HPVs 16 and 18[J].Int J Cancer,2007，120(8):1763176-1763178.

[16]Shang Q，Wang Y，F(xiàn)ang Y，et al.Human papillomavirus type 16 variant analysis of E6，E7，and L1 corrected genes and long control region in cervical carcinomas in patients in northeast China[J].J Clin Microbiol,2011，49(7):2656-2663.

[17] Wu Y，Chen Y，Li L，et al.Analysis of mutations in the E6/E7 oncogenes and L1 gene of human papillomavirus 16 cervical cancer isolates from China[J].J Gen Virol,2006,87(5):1181-1188.

[18] Sun M，Gao L，Liu Y，et al.Whole genome sequencing and evolutionary analysis of human papillomavirus type 16 in central China[J].PloS one,2012，7(5):36577.

[19]Qmichou Z，Khyatti M，Berraho M，et al.Analysis of mutations in the E6 oncogene of human papillomavirus 16 in cervicalcancerisolatesfrom Moroccan women[J].BMC Infect Dis,2013，13:378.

[20] Lee K，Magalhaes I，Clavel C，et al.Human papillomavirus 16 E6，L1，L2 and E2 gene variants in cervical lesion progression[J].Virus research,2008，131(1):106-110.

[21]Grodzki M，Besson G，Clavel C，et al.Increased risk for cervical disease progression of French women infected with the human papillomavirus type 16 E6-350G variant[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006，15(4):820-822.

[22]Zehbe I，Wilander E，Hajo Delius et al.Human papillomavirus 16 E6 variants are more prevalent in invasive cervical carcinoma than the prototype[J].Cancer Res,1998，58(4):829-833.

[23]Boumba L M，Assoumou S Z，Hilali L，et al.Genetic variability in E6 and E7 oncogenes of human papillomavirus type 16 from congolese cervical cancer isolates[J].Infect Agent Cancer,2015，10:15.

[24]Song Y S，Kee S H，Kim J W，et al.Major sequence variants in E7 gene of human papillomavirus type 16 from cervical cancerous and noncancerous lesions of Korean women[J].Gynecol Oncol,1997，66(2):275-281.