李敏，史靜雪，李志強(qiáng)，荊明龍，劉洋，陳創(chuàng)夫，張輝

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

布魯氏菌病（Brucellosis）是人和牛、羊、豬等動(dòng)物共患的傳染病，也是國(guó)家法定檢疫和撲殺被感染家畜的三大疫?。谔阋?、布魯氏菌病和結(jié)核病）之一[1]。近年來(lái)，該病在全球范圍呈不斷上升的趨勢(shì)，世界200多個(gè)國(guó)家和地區(qū)中有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有布病存在和流行，引起各國(guó)政府及研究機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。

布魯氏菌是革蘭氏陰性菌，為球桿菌或短桿菌，無(wú)鞭毛，也不形成芽孢，一般無(wú)莢膜也不產(chǎn)生外毒素。根據(jù)其流行病學(xué)特點(diǎn)、宿主偏嗜性以及基因組結(jié)構(gòu)上的差異，分為 9個(gè)種，其中對(duì)陸生動(dòng)物具有致病性的有7個(gè)種，即牛種布魯氏菌（Brucella abortus）、羊種布魯氏菌（B.melitensis）、豬種布魯氏菌（B.suis）、綿羊附睪種布魯氏菌（B.ovis）、犬種布魯氏菌（B.canis）、沙林鼠種布魯氏菌（B.neotomae）和田鼠種布魯氏菌（B.microti）。對(duì)海洋動(dòng)物具有致病性的有 2個(gè)布魯氏菌種，即鯨型布魯氏菌（B.ceti）和鰭型布魯氏菌（B.pinnipedialis）[2]。毒力相關(guān)因子主要是脂多糖、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)、Bvr R/Bvr S雙組分系統(tǒng)、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等應(yīng)激反應(yīng)蛋白，以及密度感應(yīng)系統(tǒng)等[3]。布魯氏菌的 T4SS對(duì)其逃避免疫監(jiān)視和持續(xù)性感染發(fā)揮重要作用[4]，IV型分泌系統(tǒng)能分泌復(fù)雜的效應(yīng)因子(類似于核蛋白復(fù)合體或蛋白質(zhì)類)來(lái)干預(yù)宿主細(xì)胞的功能。

為了更好的研究T4SS效應(yīng)蛋白的功能，本研究以牛種布魯氏2308為親本株，運(yùn)用同源重組的方法，針對(duì)IV型分泌系統(tǒng)的 VceC基因，構(gòu)建 2308-△VceC基因缺失突變株，旨在進(jìn)一步研究IV型分泌系統(tǒng)分泌蛋白，為探索布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、牛種布魯氏菌由本實(shí)驗(yàn)室保存，PMD19-T（sample）載體購(gòu)自 TaKaRa公司，PUC19K 載體由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、Pfu聚合酶、DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa；快速瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提取試劑盒、dNTP均購(gòu)自天根生化科技有限公司；瓊脂糖購(gòu)自上海生物技術(shù)工程有限公司；布魯氏菌液體（Brucella Broth）和布魯氏菌固體培養(yǎng)基（Brucella Agar）購(gòu)自美國(guó)BD公司；氨芐青霉素和卡那青霉素均購(gòu)自Sigma公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純化。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

在GeneBank上查找到卡那抗性基因序列和牛種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株2308的VceC基因（BAB1_1058）上下游同源臂基因序列，用Primer 5設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物和序列Tab.1 Primers and sequence

1.2.2 VceC基因上下游同源臂和卡那抗性基因的擴(kuò)增

用牛種布魯氏菌 2308基因組為模板，以VceC-N-F、VceC-N-R為引物擴(kuò)增VceC基因上游同源臂；以VceC-C-F、VceC-C-R為引物擴(kuò)增 VceC 基因下游同源臂。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性 40 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10 min；最后4℃保存。

以PUC19K質(zhì)粒為模板，以Kan-F、Kan-R為引物擴(kuò)增卡那抗性基因，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min；變性 94 ℃ 40 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min 20 s，總延伸 72℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)；最后 4℃ 保存；反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。用DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的基因。

1.2.3 VceC基因上游同源臂、卡那抗性基因和下游同源臂基因的融合

用VceC基因上游同源臂、卡那抗性基因和下游同源臂基因的膠回收產(chǎn)物按1∶1∶1混合作為模板進(jìn)行融合擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增分為2輪。

第一輪PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95℃ 5 min；變性 94℃ 30 s，退火 62℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，72℃總延伸10 min，10個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。得到缺失突變盒VceC-K。

第二輪反應(yīng)是以第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，以VceC-N-F和VceC-C-R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95℃ 5 min；變性 94℃ 40 s，退火57℃ 30 s，延伸 72℃ 3 min，72℃總延伸10 min，30個(gè)循環(huán)；最后4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。電泳產(chǎn)物根據(jù)DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作回收。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將回收的缺失突變盒VceC-K與PMD19-T載體相連，連接體系（10 μL），連接產(chǎn)物于16℃水浴鍋中過(guò)夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，涂平板（卡那霉素50 μg/mL、氨芐青霉素50 μg/mL），37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

從過(guò)夜培養(yǎng)的平板中挑取單個(gè)菌落，接種于800 μL含氨芐和卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中；37℃、120r/min培養(yǎng) 4h后，以 VceC-N-F和VceC-C-R為引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定為陽(yáng)性的菌液和質(zhì)粒測(cè)序分析。

1.2.5 牛種布魯氏菌2308-△VceC缺失突變株的構(gòu)建

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入牛種布魯氏菌2308感受態(tài)中，并且涂平板與含有卡那抗性的布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3-5 d，挑取卡那抗性平板上單克隆菌落接種于含有卡那抗性的布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌24 h后取100 μL菌液85℃滅活1 h為模板，以VceC-N-F和Kan-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。經(jīng)過(guò)初步篩選的布魯氏菌突變株經(jīng)過(guò)15次反復(fù)傳代培養(yǎng)后，分別用外部檢測(cè)引物和內(nèi)部檢測(cè)引物對(duì)布魯氏菌菌進(jìn)行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析。

1.2.6 牛種布魯氏菌2308-△VceC缺失突變株生長(zhǎng)特性檢測(cè)

分別挑取2308和2308-△VceC缺失突變株單克隆菌落接種于布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃培養(yǎng)到OD600=0.8時(shí)，然后均稀釋到OD600=0.1，繼續(xù)搖床培養(yǎng)，間隔2 h收樣測(cè)定1次OD600值，直至生長(zhǎng)到平臺(tái)期為止并繪制布魯氏菌的生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.7 牛種布魯氏菌2308-△VceC缺失突變株侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的CFU計(jì)數(shù)

將長(zhǎng)勢(shì)良好的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞（HPT-8）傳到六孔板中，每孔細(xì)胞量為106個(gè)，加入生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的布魯氏菌2308和2308-△VceC的菌量為108作用 1 h，然后每孔加入慶大霉素 5 μL（2.5 μL/mL）作用45 min再更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，此時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)到3、12、24 h時(shí)用0.1%曲達(dá)通裂解細(xì)胞涂布魯氏菌固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)3-5 d，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VceC基因的上、下游同源臂和卡那抗性基因的擴(kuò)增

以布魯氏菌2308基因組為模板對(duì)VceC基因的上、下游同源臂序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小分別約為517和546 bp的片段，與布魯氏菌VceC基因上下游同源臂的理論值相符，結(jié)果見(jiàn)圖1、2。以PUC19K為模板擴(kuò)增卡那抗性基因，獲得的基因片段約為1093 bp，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 PCR擴(kuò)增VceC基因上游同源臂Fig.1 PCR amplification upstream homology arms of VceC gene

圖2 PCR擴(kuò)增VceC基因的下游同源臂Fig.2 PCR amplification downstream homology arms of VceC gene

圖3 Kan基因的擴(kuò)增Fig.3 Amplication Kan gene

2.2 VceC基因上、下游同源臂和卡那基因的融合擴(kuò)增與載體的構(gòu)建

PCR技術(shù)進(jìn)行融合擴(kuò)增，獲得大小約2156 bp的基因序列，與VceC上下游同源臂和卡那抗性基因序列疊加的理論值一致，結(jié)果見(jiàn)圖4。將融合片段與PMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化到DH5α，獲得的重組載體PMD19-T-ΔVceC-Kan經(jīng)菌液驗(yàn)證與疊加片段大小相同，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 VceC-N-K-C融合PCRFig.4 Fusion PCR of VceC-N-K-C

2.3 布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株的初步篩選鑒定

將PMD19-T-ΔVceC-Kan質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到布魯氏菌2308感受態(tài)中，通過(guò)VceC基因上下游同源臂基因的互換，卡那抗性基因替換出染色體上的VceC基因，利用卡那抗性來(lái)篩選并獲得的突變株2308-ΔVceC， 用 VceC-N-F和 Kan-R分 別 對(duì)2308-ΔVceC和2308進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示，突變株2308-ΔVceC可擴(kuò)增出大小為1774的特異片段，而親本株2308未擴(kuò)增出來(lái)（圖6），表明抗性基因正確替換了VceC基因。

圖6 △VceC缺失株的篩選鑒定Fig.6 Screening and identification of deletion strain△VceC

2.4 布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株傳代

將鑒定正確的突變株2308-ΔVceC傳代到第15代，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中與親本株比較，肉眼未見(jiàn)變化，比如突變株的生長(zhǎng)速度，大小形態(tài)和菌落顏色等特征。分別用內(nèi)部檢測(cè)引物（VceC-F、VceC-R）和外部檢測(cè)引物（VceC-N-F、Kan-R）對(duì)每傳一代的菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，內(nèi)部檢測(cè)引物只有2308株出現(xiàn)特異性條帶而外部檢測(cè)引物只有2308株未出現(xiàn)特異性條帶，達(dá)到了預(yù)想的結(jié)果（圖7、8），說(shuō)明成功獲得了2308-ΔVceC突變株，并且基因突變株經(jīng)過(guò)15代連續(xù)培養(yǎng)后未發(fā)生回復(fù)突變現(xiàn)象，即2308-ΔVceC可進(jìn)行穩(wěn)定遺傳。

圖5 同源重組載體PMD19-T-ΔVceC-Kan的菌液PCR鑒定Fig.5 Bacteria PCR identification homologous recombination vectors PMD19-T-ΔVceC-Kan

圖7 內(nèi)部引物檢測(cè)缺失株Fig.7 Internal primer detection deletion strain

圖8 外部引物檢測(cè)缺失株Fig.8 External primers to detect deficient strains

2.5 布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株生長(zhǎng)特性檢測(cè)

圖9 牛種布魯氏菌2308-ΔVceC缺失突變株與親本株2308的生長(zhǎng)曲線Fig.9 The growth curve ofB.abortus2308-ΔVceC strain andB.abortus2308 strain

由圖9可見(jiàn)，牛種布魯氏菌2308-ΔVceC和它的親本株2308生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，12 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，30 h時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。

2.6 牛布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株侵染HPT-8細(xì)胞

用布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株和其本株以50∶1的侵染復(fù)數(shù)侵染HPT-8細(xì)胞，在侵染后3、12、24 h時(shí)用曲達(dá)通裂解細(xì)胞收樣，并且梯度稀釋至102和103，分別涂于布魯氏菌固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-5 d數(shù)菌落數(shù)。計(jì)算log值繪制柱狀圖（圖10），侵染12 h后缺失株胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量明顯下降（P＜0.01）。12 h時(shí)親本株2308和2308-ΔVceC缺失突變株差異顯著（P＜0.05）。

圖10 牛布魯氏菌2308-ΔVceC和2308在HPT-8細(xì)胞中的存活能力Fig.10 The survival ability ofB.abortus2308-ΔVceC strain andB.abortus2308 strain in cell HPT-8

3 討論

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種動(dòng)物源性人畜共患傳染病。該病的典型癥狀是波浪熱，動(dòng)物發(fā)病后最顯著癥狀是引起懷孕母蓄流產(chǎn)和公畜發(fā)生睪丸炎、附睪炎或關(guān)節(jié)炎[4]。人感染布病后，也可導(dǎo)致流產(chǎn)和不育，而且病程長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作、長(zhǎng)期不愈，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。布魯氏菌T4SS最早在B.suis基因組中發(fā)現(xiàn)，位于II號(hào)染色體上，是12種蛋白組成的蛋白復(fù)合體[5]。Ⅳ型分泌系統(tǒng)主要是通過(guò)分泌各種效應(yīng)分子來(lái)逃避宿主細(xì)胞的防御機(jī)制，對(duì)于致病性細(xì)菌而言，這些分泌性的蛋白幫助細(xì)菌發(fā)揮定殖、吸附等作用，還可以調(diào)理宿主細(xì)胞，逃逸宿主的免疫機(jī)制等[6-8]。

VceC和Vce A是第一次被鑒定出的布魯氏菌T4SS分泌蛋白，其感染布魯氏菌后，VceC最先進(jìn)入巨噬細(xì)胞[9]。研究人員發(fā)現(xiàn)VceC被轉(zhuǎn)運(yùn)到巨噬細(xì)胞中，引起 LDH 釋放增加，顯示了其細(xì)胞毒性，張沾等[10，13]在VceC的研究中也發(fā)現(xiàn)其對(duì)人的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞具有毒性。研究還證明VceC能夠與細(xì)胞的Bip蛋白結(jié)合，布魯氏菌利用VceC募集 Bip，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊反應(yīng)（UPR），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)被破壞。本研究以牛種布魯氏菌2308為基礎(chǔ)構(gòu)建分泌蛋白VceC的基因缺失突變株為進(jìn)一步研究T4SS的分泌蛋白功能提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

本研究根據(jù)同源重組的原理構(gòu)建了牛種布魯氏菌2308-△VceC基因缺失突變株，布魯氏菌是胞內(nèi)寄生菌，無(wú)質(zhì)粒，而且大多數(shù)外源的質(zhì)粒不能在其中復(fù)制，所以很多質(zhì)粒均可作為自殺載體來(lái)構(gòu)建布魯氏菌的基因突變株[12，15-16]，不同于傳統(tǒng)的缺失突變株構(gòu)建載體，本研究中利用T載體來(lái)構(gòu)建牛種布魯氏菌2308-△VceC基因缺失突變株，抗性基因替換的方法避免了質(zhì)粒整合帶來(lái)的問(wèn)題，此方法較傳統(tǒng)構(gòu)建自殺載體的方法更加簡(jiǎn)便快速[13-14]，無(wú)需酶切連接的過(guò)程，簡(jiǎn)化了突變載體構(gòu)建的步驟，同時(shí)的檢出假陽(yáng)性概率低的優(yōu)點(diǎn)，可大幅提高研究VceC基因功能的效率，而且此方法具有一個(gè)篩選標(biāo)記，通過(guò)篩選可容易得到突變株[13]。

本研究還進(jìn)一步研究了牛種布魯氏菌2308-△VceC基因缺失突變株和其親本株在生長(zhǎng)特性上的區(qū)別，由圖9可見(jiàn)突變株和親本株在生長(zhǎng)趨勢(shì)上無(wú)顯著區(qū)別，基本趨于一致，所以VceC基因的缺失，不會(huì)對(duì)牛種布魯氏菌2308的生長(zhǎng)規(guī)律或生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生較大影響。其對(duì)HPT-8細(xì)胞的侵襲力，根據(jù)胞內(nèi)CFU計(jì)數(shù)結(jié)果，12 h時(shí)缺失株在胞內(nèi)的存活率開(kāi)始下降而其親本株卻開(kāi)始增殖復(fù)制，親本株2308和2308-ΔVceC缺失突變株在12 h時(shí)差異顯著。這可能與布魯氏菌VceC蛋白的功能密切相關(guān)。本研究可為布魯氏菌致病機(jī)制的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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