石穎+楊江媛+何仕梅

摘要：目的觀(guān)察乳寧合劑對(duì)乳腺癌小鼠癌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)和微血管密度（MVD）的影響。方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)分為乳腺癌模型組、參一膠囊組、乳寧合劑高、中、低劑量組。分組給藥21 d后，免疫組化法測(cè)定腫瘤組織中的VEGF和MVD。結(jié)果與模型組相比，乳寧合劑高、中劑量組及參一膠囊組均可明顯降低VEGF和MVD表達(dá)（P<0.05），其中以參一膠囊組作用最為明顯，乳寧合劑高、中劑量組次之，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論乳寧合劑可能通過(guò)抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：乳寧合劑；乳腺癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；微血管密度

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）04-0085-02

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中具有特殊生物學(xué)行為和臨床病理特征的一種獨(dú)立類(lèi)型，占乳腺癌總發(fā)病率的10～20.8%[1]。現(xiàn)有研究表明與非TNBC相比，TNBC具有侵襲性高、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、疾病進(jìn)展快、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高等特點(diǎn)[2]，目前尚無(wú)明確針對(duì)TNBC的治療標(biāo)準(zhǔn)。

全國(guó)第四、第五批老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師、云南省名中醫(yī)李斯文教授在三陰性乳腺癌的治療中主張從腎論治，以補(bǔ)腎活血方藥為主組成的乳寧合劑即為此而設(shè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠三陰性乳腺癌模型，采用免疫組化法檢測(cè)VEGF和MVD在腫瘤組織中的表達(dá)情況，探討乳寧合劑抗三陰性乳腺癌的作用機(jī)理。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞系4～6周齡雌性BALB/c（nu/nu）小鼠，SPF級(jí)，體重18±2 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2007-0001，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞培養(yǎng)中心。

1.2藥物中藥乳寧合劑主要由熟地、仙靈脾、菟絲子、枸杞子、丹參、郁金、莪術(shù)、八月札、薏苡仁、當(dāng)歸等組成。以上中藥飲片均由云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，由本院制劑室制備，制劑方法：將中藥浸泡2 h，常規(guī)煎煮3次，合并3次濾液，濃縮藥液濃度相當(dāng)于3.2 g/mL，4℃冰箱保存。參一膠囊（吉林亞泰制藥股份有限公司，批號(hào)：20140910）。

1.3試劑ZLI一9032濃縮型DAB試劑盒、兔抗鼠CD34單克隆抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：60882801。

1.4儀器電子天平JS1603-C：瑞士meittler公司；STPl20脫水機(jī)：MICROM公司；AF280—2包埋機(jī)：MICROM公司；HM335E切片機(jī)：MICROM公司；Nikon e.elipse 80i顯微鏡：Nikon公司；Carl Zeiss In--sing Systems：CarlZeiss公司；DRP-9052型電熱恒溫箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BG-270隔水式電熱恒溫箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)。

2方法

2.1乳腺癌小鼠模型制備、分組及給藥在無(wú)菌條件下，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TNBC MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×107個(gè)/mL，以0.2 mL/只的量接種于BALB/C雌性小鼠左側(cè)腋部皮下，待小鼠皮下實(shí)體瘤直徑長(zhǎng)至5 mm時(shí)隨機(jī)分組給藥。參一膠囊組用生理鹽水配成5 mg/kg混懸液；乳寧合劑高、中、低劑量組分別以生理鹽水配成32 g/kg，16 g/kg，8 g/kg的藥液；以上各組均以10 mL/kg/只灌胃，每日1次；乳腺癌模型組每日給予等量生理鹽水灌胃。以上各組連續(xù)給藥3周。

2.2觀(guān)察指標(biāo)測(cè)定

2.2.1瘤重、抑瘤率檢測(cè)持續(xù)灌胃21 d后次日處死小鼠，剝離瘤體，用電子天平稱(chēng)取各組小鼠實(shí)體瘤重量（W），計(jì)算抑瘤率（I）[3]：I=（對(duì)照組W—治療組W）/對(duì)照組W×100%。

2.2.2小鼠瘤組織VEGF表達(dá)的測(cè)定瘤體取下后經(jīng)10%甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，于腫瘤最大切面組織塊處做3～5um的連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組化染色。切片置于60℃烤箱烘烤2 h；切片脫蠟至水；蒸餾水洗2 min；高壓熱修復(fù)：高壓鍋內(nèi)放適量自來(lái)水，將修復(fù)液倒入燒杯內(nèi)，將燒杯置于高壓鍋內(nèi)煮沸，將切片放入裝有修復(fù)液的燒杯內(nèi)，加熱至設(shè)定壓力冒氣后持續(xù)2 min，自來(lái)水冷卻；3%H2O2溶液阻斷過(guò)氧化物酶10 min；PBS洗5 min×3次；滴加一抗，37℃孵育60分鐘；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育60min；PBS洗5 min×3次；DAB顯色；復(fù)染、透明封片，鏡下觀(guān)察。

2.2.3小鼠瘤組織MVD計(jì)算VEGF免疫組化法染色后，先在低倍鏡（×100）下全面觀(guān)察切片以確定腫瘤內(nèi)血管密度最高處，高血管密度區(qū)多位于腫瘤邊緣。在高倍鏡（×400）下，以腫瘤內(nèi)任何一個(gè)棕色染色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢作為一個(gè)血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)。記錄5個(gè)視野內(nèi)的微血管個(gè)數(shù)，取其平均數(shù)作為該切片MVD值。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSSl3.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，多組間比較用方差分析，然后用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1乳寧合劑對(duì)小鼠移植瘤的抑瘤作用結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2乳寧合劑對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織VEGF、MVD的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，乳寧合劑各劑量組和參一膠囊組的VEGF、MVD表達(dá)均小于模型組，其中乳寧合劑高、中劑量組VEGF、MVD與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示乳寧合劑對(duì)MDA-MB-23乳腺癌移植瘤VEGF、MVD的表達(dá)有抑制作用，高劑量組作用較為明顯。

4討論

Hanahan等[4]于1996年提出血管生成的開(kāi)關(guān)平衡假說(shuō)，認(rèn)為血管生成受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的共同調(diào)控。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前研究最廣泛、作用最強(qiáng)的血管生成正調(diào)控因子。它主要通過(guò)自分泌或旁分泌與內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體（VEGFR）結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖、遷移，增加毛細(xì)血管通透性，刺激腫瘤新生血管生成[5～6]。微血管密度（MVD）直接量化反映腫瘤血管生成的程度，不僅與腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和供氧有關(guān)，而且反映了腫瘤的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力[7]。由于三陰性乳腺癌較高的侵襲、轉(zhuǎn)移特性，抗腫瘤血管生成對(duì)三陰性乳腺癌的治療具有重要意義。故本文選擇VEGF、MVD為觀(guān)察指標(biāo)，探討了不同劑量的乳寧合劑對(duì)三陰性乳腺癌組織血管生成的影響。

在多年的腫瘤防治工作中，云南省名中醫(yī)李斯文教授體會(huì)到肝脾腎、沖任二脈功能失調(diào)與乳腺癌的發(fā)病密不可分，其中尤以腎居于核心地位。李斯文教授認(rèn)為，腎水虧虛，則肝木失于涵養(yǎng)，其調(diào)達(dá)之性不能伸展，易于怫郁，氣滯日久，木壅侮土，脾胃受損，脾失健運(yùn)，痰濕內(nèi)聚，氣機(jī)不暢，血滯為瘀，痰瘀膠結(jié)，循厥陰之脈聚于乳房而成癥瘕。腎主生殖，為沖任之本，腎虛則肝脾、沖任易病，腎強(qiáng)則肝脾、沖任易調(diào)。因此，在治療中堅(jiān)持“腎為核心”、“益腎為先”的治療原則，并貫徹病程治療始終。李教授還認(rèn)為腎元虧虛是乳腺癌發(fā)病的始動(dòng)因素，由其導(dǎo)致的瘀血阻滯在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占有重要地位。以補(bǔ)腎為基礎(chǔ)的補(bǔ)腎活血法是乳腺癌治療的重要法則，凝聚李斯文教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)的乳寧合劑即為此而設(shè)。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與模型組比較，乳寧合劑高、中劑量組和參一膠囊組均能夠明顯降低移植瘤組織VEGF表達(dá)和MVD（P<0.05），而以參一膠囊組作用最強(qiáng)，乳寧合劑高劑量組次之。初步證實(shí)了乳寧合劑通過(guò)降低腫瘤組織VEGF表達(dá)、MVD而抑制TNBC微血管的生成。此研究結(jié)果為進(jìn)一步展開(kāi)乳寧合劑抗腫瘤及其抗腫瘤血管生成研究奠定了基礎(chǔ)。從微觀(guān)上證實(shí)了從補(bǔ)腎活血治療TNBC的可行性，為臨床預(yù)防TNBC的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的思路和方法。

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