鄭小華　何守搞

[摘要]目的 探討肝再生磷酸酶-3（PRL-3）與RhoC在不同病理進程的胃癌組織及癌前病變組織的表達情況及臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測不同病理分期的胃癌組織及癌前病變組織中PRL-3和Rho-C的蛋白表達情況，用統(tǒng)計方法分析二者在不同分組間的表達差異性及二者的相關(guān)性。結(jié)果 在胃癌中PRL-3陽性表達率為68.0%（34/50），RhoC陽性表達率為62.0%（31/50），二者在胃癌及癌前病變組織之間的表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；二者在不同分化、浸潤深度、TNM分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的分組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），同時二者的表達具有相關(guān)性（r.=0.35，P<0.05）。結(jié)論 PRL-3與RhoC在胃癌及癌前病變組織的表達水平一定程度上提示二者可能對胃癌的生長及轉(zhuǎn)移有重要的意義：PRL-3可能對RhoC存在調(diào)節(jié)作用，二者有望成為胃癌早期診斷的標記物，為治療提供新的靶向分子。

[關(guān)鍵詞]胃癌；PRL-3；Rhoc；免疫組化

胃癌是消化系統(tǒng)惡性疾病中最好發(fā)的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計在全國范圍內(nèi)其發(fā)病率位于惡性腫瘤排名的第二位，并且其患病率中年輕化所占比例較前有所增加。目前傳統(tǒng)手術(shù)切除、放化療及新型的分子靶向治療對晚期胃癌療效不佳。因此探索胃癌中各致癌因子的作用機制及相互之間的聯(lián)系，對早期胃癌的診斷和提高晚期胃癌患者的預后具有重要的研究價值。肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3），又稱為PTP4A3，是—個雙特異性磷酸酶。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其參與腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲過程，被認為是腫瘤診斷和靶向治療潛在的標志分子。RhoC屬于小分子G蛋白超家族中的Rho亞家族.是Rho基因家族的重要成員。RhoC蛋白參與許多重要的細胞活動，如調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白和細胞凋亡.改變細胞黏附和細胞運動。目前的研究發(fā)現(xiàn)二者都可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展.但兩者在胃癌中作用的分子機制及兩者的相互關(guān)系未完全闡明。所以我們采用免疫組化方法檢測PRL-3與RhoC在胃癌癌前病變組織、Ⅰ/Ⅱ期胃癌及Ⅲ/Ⅳ期胃癌組織的表達情況，分析其與胃癌病理特征的關(guān)系，并探討兩者的表達是否存在相關(guān)性。

1.對象與方法

1.1研究對象 收集2015年3月-2016年6月在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科手術(shù)切除且資料完整的胃癌患者50例，其中Ⅰ-Ⅱ期22例、Ⅲ-Ⅳ期28例.所有患者術(shù)前未經(jīng)放化療及免疫治療，其中男25例，女25例；年齡30-76歲，平均（64.14±12.17）歲；腫瘤分化：高、中分化23例，低分化27例；侵及漿膜及漿膜以外者27例，未侵及漿膜者23例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。另外收集我院病理科慢性萎縮性胃炎和胃潰瘍的石蠟標本，按病檢結(jié)果分類：腸腺化生、低級別瘤變、高級別瘤變，樣本量各50例。

1.2檢測方法 新鮮標本常規(guī)用10%中性甲醛溶液固定，24 h內(nèi)取材，脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)4Ixm厚度切片。免疫組化法：常規(guī)二甲苯、乙醇逐級脫蠟至水化.除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，加檸檬酸鹽緩沖液后微波修復抗原，自然冷卻至室溫，加血清封閉，加一抗（選擇合適的稀釋比例：1：80的抗PRL-3抗體，1：60的抗RhoC抗體），將切片放入濕盒中，再將濕盒于40C冰箱過夜，第二日將濕盒放人37℃溫箱中復溫0.5 h，PBS洗5 min×3次，加二抗，加DAB顯色劑，水洗終止顯色，蘇木精復染，逐級酒精脫水，中性樹膠封片，電熱扇吹干后鏡下觀察。用PRL-3強陽性表達的結(jié)腸癌、RhoC強陽性表達的十二指腸癌組織切片作為陽性對照.PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3結(jié)果判斷標準 每張切片由我院病理科兩位高級職稱醫(yī)師獨立閱片，隨機選10個不同的視野分別計數(shù)陽性細胞數(shù)并計算其算術(shù)平均值。采用雙評分半定量法進行評分。（1）顯色度按切片中細胞顯色有無及深淺記分：細胞不顯色記為0分，淺棕黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。（2）對于每張切片中陽性腫瘤細胞或變性細胞所占百分比分四個等級：陽性細胞<10%記為0分，10%-25%記為1分，26%-50%記為2分，>50%記為3分。（3）將（1）、（2）得分相加，得0-1分為（-）陰性表達，2-3分為（+）低度表達，4-5分為（++）中度表達，6分為（+++）強度表達。即2-6為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行處理，計數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用x2檢驗，等級分組資料采用成組設計多個樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis法）.進一步兩兩比較采用4個樣本間兩兩比較的秩和檢驗（Nemenyi法），對兩者表達的相關(guān)性基于有序變量的等級資料采用Spearman檢驗進行統(tǒng)計學分析，檢驗水準：a=0.05。

2.結(jié)果

2.1免疫組織化學染色 顯示PRL-3和RhoC蛋白表達主要定位于細胞質(zhì)或細胞膜上，呈黃色、棕黃色及棕褐色顆粒。見圖1。

2.2PRL-3與RhoC在胃癌及癌前病變組織的表達情況 PRL-3、RhoC在胃癌組織及癌前病變組織中的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001），再依次兩兩比較，部分類型之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示，PRL-3和RhoC蛋白陽性表達率隨著胃黏膜從腸上皮化生逐漸向癌變演變，其強弱順序均為：腸上皮化生<低級別瘤變<高級瘤變<胃癌。見表1、表2。

2.3PRL-3和RhoC的表達與胃癌臨床病理學特征的關(guān)系 50例胃癌組織中有34例PRL-3蛋白呈陽性表達，陽性表達率為68.0%，其表達與胃癌患者的性別、年齡大小無明顯相關(guān)（P>0.05），但是隨著胃癌組織浸潤深度的加深、分化程度的降低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生.其陽性表達率明顯升高，表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或0.01）。50例胃癌組織中有31例RhoC呈陽性表達，陽性表達率為62.0%，其表達與胃癌患者的性別、年齡大小無明顯相關(guān)（P>0.05），但是隨著胃癌組織浸潤深度的加深、分化程度的降低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，其陽性表達率明顯升高，表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或0.01）。見表3。

2.4PRL-3與RhoC在胃癌組織中表達情況的相關(guān)性分析 基于有序變量的等級資料.應用Spearman檢驗對PRL-3和RhoC蛋白在胃癌中表達相關(guān)性進行分析，結(jié)果：r.=0.35，P<0.05，說明二者在胃癌中的表達存在較強的相關(guān)性。見表4。

3.討論

PRL-3是相對分子質(zhì)量為22 kD的非典型磷酸酪氨酸蛋白磷酸酯酶，其分子結(jié)構(gòu)特點是有氨基末端的PTP催化活性結(jié)構(gòu)域和羧基末端的異戊二烯化修飾位點CAAX序列。國外學者Saha等首次發(fā)現(xiàn)PRL-3在結(jié)腸癌中高表達并與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，后續(xù)的研究者發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤組織中高表達，諸如：乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌等。蔡世榮等對137例胃癌組織進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)PRL-3高表達的胃癌患者占62%和低-中度的PRL-3表達的胃癌患者占19%，并且PRL-3的表達在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織。盡管PRL-3與腫瘤關(guān)系的分子機制未完全闡明.但越來越多的研究證明其對惡性腫瘤的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移作用，與其介導的上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、上調(diào)金屬蛋白酶（MMP）降解基質(zhì)和誘導腫瘤新生血管生成的機制密不可分。PRL-3的這些生物學功能一定程度上解釋了它在惡性腫瘤中所起的重要作用。我們通過免疫組化法研究了PRL-3在胃癌癌前病變組織（腸上皮化生、低級別瘤變、高級瘤變）的表達時，發(fā)現(xiàn)隨著胃黏膜癌前病變組織逐漸向胃癌演變.其表達強度依次呈遞增趨勢.由此我們推測PRL-3可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在50例胃癌組織中，PRL-3陽性表達率為68%，其與胃癌的浸潤深度、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這些研究結(jié)果與前人的研究有所相似，進一步揭示了PRL-3與胃癌轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系。

RhoC蛋白是RhoGTP酶家族的一個重要的成員，其基因定位于lpl3-p21，其蛋白含193個氨基酸，相對分子質(zhì)量大約為21 KD的GTP結(jié)合蛋白。Clark等首次應用DNA Array檢測發(fā)現(xiàn)RhoC基因的表達與黑色素瘤的高轉(zhuǎn)移性直接相關(guān)，從此研究者們開啟了RhoC對腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究。相繼的研究發(fā)現(xiàn).RhoC亦在多種腫瘤組織中高表達，其可通過相關(guān)信號通道促進腫瘤組織EMT的發(fā)生和腫瘤血管的形成，進而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。近年來研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RhoC還能明顯上調(diào)MMPs的表達水平及增加其活性，使降解胞外基質(zhì)能力增強，從而導致腫瘤侵襲活性的增強。本研究免疫組化結(jié)果顯示，RhoC在胃癌及癌前病變組織的表達情況，如同前文PRL-3所述的表達，這一現(xiàn)象提示兩者可能存在相互作用，共同參與胃癌轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)過程。

我們的研究還發(fā)現(xiàn).PRL-3與RhoC在胃癌中的表達呈正相關(guān)，在浸潤較深、組織分化低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中RL-3和RhoC蛋白的表達都較高，與張平等人的研究結(jié)果一致。覃宗帥等用不同濃度的PRL-3抗體作用于胃癌SGC7901細胞后.發(fā)現(xiàn)較高濃度的PRL-3抗體能明顯下調(diào)RhoCmRNA和蛋白的表達量。Ming等阻斷PRL-3在肺癌A549細胞的表達后，RhoC的表達亦受到抑制，接著再阻斷RhoC的表達，PRL-3的表達不受影響。通過本實驗的研究結(jié)合上述研究者的研究結(jié)果，可以推測PRL-3與RhoC可能在同一信號通道中，PRL-3可能通過調(diào)控RhoC的表達促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲，尤其對胃癌的轉(zhuǎn)移起著重要的作用。但PRL-3是否直接作用于RhoC，是否涉及其他分子調(diào)節(jié)RhoC蛋白，同時RhoC蛋白是否對PRL-3具有反饋作用等還需進一步的實驗來闡明。