蔣國(guó)紅，王長(zhǎng)明，張麗(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

PI3K/AKT/FoxO信號(hào)通路在胰島素類似生長(zhǎng)因子1調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞PRNP基因表達(dá)中的作用

蔣國(guó)紅，王長(zhǎng)明，張麗
(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族蛋白( FoxO)信號(hào)通路在胰島素類似生長(zhǎng)因子1(IGF-1)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞PC12細(xì)胞株P(guān)RNP基因表達(dá)中發(fā)揮的作用。方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞分為IGF-1組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組。IGF-1組加入終濃度80 ng/mL的IGF-1；實(shí)驗(yàn)1、2組先加入25、50 μmol/L的PI3K /AKT/FoxO信號(hào)通路抑制劑LY294002， 37 ℃培養(yǎng)30 min后再滴入80 ng/mL的 IGF-1。對(duì)照組不加藥物。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)算各組PC12細(xì)胞PRNP mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用Western blotting法測(cè)算各組PC12細(xì)胞AKT、磷酸化AKT(pAKT)、FoxO3a和磷酸化FoxO3a(pFoxO3a)蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 IGF-1組PC12細(xì)胞PRNP mRNA及pAKT、pFoxO3a蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)1、2組PC12細(xì)胞PRNP mRNA及pAKT、pFoxO3a蛋白相對(duì)表達(dá)量低于IGF-1組(P均<0.05)，且實(shí)驗(yàn)2組低于實(shí)驗(yàn)1組(P均<0.05)。結(jié)論 IGF-1通過(guò)磷酸化PI3K /AKT/FoxO信號(hào)通路蛋白AKT、FoxO3a調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞PRNP基因表達(dá)。

磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族蛋白；胰島素樣生長(zhǎng)因子1；PRNP基因

研究發(fā)現(xiàn)朊蛋白在β淀粉樣多肽誘發(fā)阿爾茨海默病(AD)的過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用[1]。朊蛋白由管家基因PRNP編碼[2]。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族蛋白( FoxO)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路的下游蛋白。PI3K/AKT/FoxO信號(hào)通路參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡等多種生理過(guò)程[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胰島素類似生長(zhǎng)因子(IGF-1)能夠調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞PC12細(xì)胞株P(guān)RNP基因的表達(dá)，但這種調(diào)控作用是否通過(guò)PI3K/AKT/FoxO信號(hào)通路尚不明確。為明確PI3K/AKT/FoxO信號(hào)通路在IGF-1調(diào)節(jié)PC12細(xì)胞PRNP基因表達(dá)中的作用，筆者先在體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞中加入不同濃度的PI3K/AKT/FoxO信號(hào)通路抑制劑LY294002，然后再加入IGF-1繼續(xù)培養(yǎng)，比較PC12細(xì)胞PRNP基因表達(dá)情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 PC12細(xì)胞購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；IGF-1購(gòu)于Sigma公司；TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas公司；PI3K抑制劑LY294002購(gòu)自碧云天公司；FoxO3a、磷酸化FoxO3a蛋白(pFoxO3a)、AKT、磷酸化pAKT、GAPDH抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、PVDF膜購(gòu)于Promega公司。

1.2 細(xì)胞分組及IGF-1、 LY294002用法 將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液，約2 d傳代一次，每次取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁80%后，用胰酶消化后傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為IGF-1組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組。IGF-1組加入終濃度80 ng/mL的IGF-1；實(shí)驗(yàn)1、2組先加入25、50 μmol/L的LY294002， 37 ℃培養(yǎng)30 min后再滴入80 ng/mL的 IGF-1。對(duì)照組組不加藥物。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.3 各組PC12細(xì)胞PRNP mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)算方法 收集各組細(xì)胞，用裂解液裂解，置于4 ℃下12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移并分裝上清液，存于-80 ℃冰箱備用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組PC12細(xì)胞PRNP mRNA。PRNP上游引物：5′-GGAGAACTTCACGGAGACCG-3′，下游引物：5′-CTCCCGTCGTAATAGGCCTG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3′，下游引物：5′-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′。以GAPDH為內(nèi)參照。以2-ΔΔCt表示PRNP mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 各組PC12細(xì)胞AKT、磷酸化AKT(pAKT)、FoxO3a、磷酸化FoxO3a(pFoxO3a)相對(duì)表達(dá)量測(cè)算方法 采用Western blotting法。從各組細(xì)胞裂解液中提取總蛋白，用SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加AKT/pAKT、FoxO3a/pFoxO3a、GAPDH一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，洗膜、化學(xué)發(fā)光、顯影、掃描，成像。AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a條帶和內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值的比值為各組AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組PC12細(xì)胞PRNP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 對(duì)照組、IGF-1組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組PC12細(xì)胞PRNP mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.06、3.03±0.26、2.06±0.16、1.34±0.36。IGF-1組PC12細(xì)胞PRNP mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，P<0.05。實(shí)驗(yàn)1、2組PC12細(xì)胞PRNP mRNA相對(duì)表達(dá)量低于IGF-1組，且實(shí)驗(yàn)2組低于實(shí)驗(yàn)1組，P均<0.05。

2.2 各組PC12細(xì)胞AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組PC12細(xì)胞AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，各組PC12細(xì)胞AKT、FoxO3a相對(duì)表達(dá)量相比，P均>0.05。IGF-1組PC12細(xì)胞pAKT、pFoxO3a相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，P均<0.05。實(shí)驗(yàn)1、2組PC12細(xì)胞pAKT、pFoxO3a相對(duì)表達(dá)量均低于IGF-1組，且實(shí)驗(yàn)2組低于實(shí)驗(yàn)1組，P均<0.05。

表1 各組PC12細(xì)胞AKT、pAKT、FoxO3a、pFoxO3a蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與IGF-1組相比，#P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，ΔP<0.05。

3 討論

已有研究顯示，AD特征性病理改變與腦部胰島素、IGF-1所介導(dǎo)的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)紊亂相關(guān)[4]。IGF-1是一種重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其受體IGF-1R在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)。有報(bào)道證明IGF-1在AD等神經(jīng)退化性疾病中具有重要作用(如IGF-1可以影響Aβ的清除和tau蛋白的磷酸化)，此過(guò)程與PI3K/AKT 和MAPK/ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)[5]。本研究在前期的實(shí)驗(yàn)中亦得出相同結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)此過(guò)程涉及IGF-1調(diào)控PRNP基因的表達(dá)。為進(jìn)一步了解IGF-1調(diào)節(jié)PRNP基因表達(dá)的機(jī)制，本研究首先選擇其中一條信號(hào)通路，即IGF-1-PI3K/AKT-PRNP通路，進(jìn)行詳細(xì)研究。

研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路可以作為治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的重要方向和突破口[6]。生長(zhǎng)因子等可激活PI3K通路，激活A(yù)KT磷酸化，進(jìn)而磷酸化凋亡基因，使其失活，抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元的存活[7]。LY294002[2-(4-馬啉基)-8-苯基-4-氫-1-苯并吡喃-4-酮]是類黃酮衍生物的一種，抑制PI3K活性的機(jī)制是通過(guò)可逆競(jìng)爭(zhēng)PI3K的ATP結(jié)合位點(diǎn)，其具有的特異性抑制作用，常被應(yīng)用于PI3K相關(guān)的細(xì)胞功能的研究中[8]。FoxO蛋白是胰島素類似生長(zhǎng)因子/胰島素信號(hào)通路下游一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，人類有4個(gè)FoxO同源基因，分別為FoxO1、FoxO2、FoxO3a和FoxO4。FoxO轉(zhuǎn)錄因子(FoxO1、FoxO3a)廣泛表達(dá)于成人的各組織器官中，包括心、腦等[9]。近年來(lái)，人們通過(guò)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)FoxO3a涉及兩方面的功能：既可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、增殖(PI3K/AKT通路被激活時(shí)磷酸化或Sirt1調(diào)控下去乙?；?，也可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡(在PI3K/AKT通路受抑制時(shí)去磷酸化或p300調(diào)節(jié)下乙?；?[10]。

AKT存在于各種不同類型細(xì)胞中，是PI3K下游調(diào)控器，F(xiàn)oxO是AKT的一下游靶點(diǎn)，AKT通過(guò)磷酸化方式來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)FoxO3a的活動(dòng)。研究表明磷酸化的AKT可以抑制 FoxO3a在細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)，進(jìn)而抑制其促凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)[11]。本研究結(jié)果顯示，IGF-1可提高PC12細(xì)胞PRNP mRNA，這與前期研究一致；加入LY294002的PC12細(xì)胞由IGF-1導(dǎo)致的PRNP mRNA表達(dá)上調(diào)被抑制，并呈劑量依賴性。同樣，AKT的磷酸化水平也可被IGF-1誘導(dǎo)提高，但被LY294002抑制。FoxO3a蛋白表達(dá)不受二者影響，但FoxO3a蛋白磷酸化水平發(fā)生顯著變化，其趨勢(shì)與pAKT相同。提示，IGF-1 對(duì)PNRP的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)PI3K/AKT/FoxO信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，AKT及FoxO3a蛋白磷酸化的變化可能在其中起到重要調(diào)控作用。

綜上所述，IGF-1能夠通過(guò)PI3K/AKT/FoxO信號(hào)通路調(diào)控PC12細(xì)胞PRNP基因的表達(dá)，進(jìn)而引起相關(guān)疾病(如AD等)的發(fā)生。該過(guò)程可能的機(jī)制為：IGF-1可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，先是磷酸化AKT，然后進(jìn)一步磷酸化FoxO3a，進(jìn)而抑制了FoxO3a對(duì)PRNP基因的負(fù)調(diào)控功能，最終導(dǎo)致PRNP基因表達(dá)增強(qiáng)。但FoxO3a磷酸化后其在細(xì)胞內(nèi)是如何分配定位及采用何種方式調(diào)節(jié)尚不明確。此外，磷酸化的AKT對(duì)FoxO3a活性是否還存在其他影響，以及FoxO3a蛋白是否直接影響PRNP基因表達(dá)等也有待進(jìn)一步研究。

[1] Roychaudhuri R, Yang M, Hoshi MM, et al. Amyloid beta-protein assembly and Alzheimer disease [J]. J Biol Chem, 2009, 284(8):4749-4753.

[2] Lauren J, Gimbel DA, Nygaard HB, et al. Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers [J]. Nature, 2009,457(7233):1128-1132.

[3] Puig O, Marr MT, Ruhf ML, et al. Control of cell number by Drosophila FoxO: downstream and feedback regulation of the insulin receptor pathway[J]. Genes Dev, 2003,17(16):2006-2020.

[4] Aileen MM, Rebecca JG, Suzanne T, et al. Defects in IGF-1 receptor, insulin receptor and IRS 1/2 in Alzheimer′s disease indicate possible resistance to IGF-1 and insulinsignaling[J].Neurobiol Aging, 2010, 31(3):224-243.

[5] Zhang H, Gao Y, Dai Z, et al. IGF-1 reduces BACE-1 expression in PC12 cells via-activation of PI3K/AKT and MAPK/ERK1/2 signaling pathways[J].Neurochem Res, 2011,36(1):49-57.

[6] Salker MS, Steel JH, Hosseinzadeh Z, et al. Activation of SGK1 in Endometrial Epithelial Cells in Response to PI3K/AKT Inhibition Impairs Embryo Implantation[J].Cell Physiol Biochem, 2016,39(5):2077-2087.

[7] Burke RE. Inhibition of mitogen-activated protein kinase and stimulation of Akt kinase signaling pathways:Two approaches with therapeutic potential in the treatment of neurodegenerative disease[J]. Pharmacol Ther, 2007,114(2):261-277.

[8] Jiang QG,Li TY,Liu DN, et al. PI3K/Akt pathway involving into apoptosis and invasion in human colon cancer cells LoVo[J]. Mol Biol Rep，2014，41(5):3359-3367.

[9] Brunet A, Sweeney LB, Sturgill JF, et al. Stress-dependent regulation of FoxO transcription factors by the SIRT1 deacetylase[J]. Science, 2004,303(5666):2011-2015.

[10] Aileen MM, Rebecca JG, Suzanne T, et al. Defects in IGF-1 receptor, insulin receptor and IRS 1/2 in Alzheimer′s disease indicate possible resistance to IGF-1andinsulinsignaling J [J].Neurobiol Aging, 2010,31(3):224-243.

[11] Kim SJ, Winter K, Nian C, et al. Glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) stimulation of pancreatic beta-cell survival is dependent upon phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (PKB) signaling, inactivation of the forkhead transcription factor Foxo1, and down- egulation of bax expression[J]. J Biol Chem，2005,280(23):22297-22307.

[12] Xuan ZY, Zhang MQ .From worm to human: bioinformatics approaches to identify FoxO tarcyet genes[J]. Mechanisms Ageing Develop, 2005,126(5):209-221.

Effects of PI3K/Akt/FoxO signaling pathway on PRNP expression of insulin-like growth factor 1 regulating nerve cells

JIANGGuohong,WANGChangming,ZHANGLi

(TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

Objective To explore the effects of phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/forkhead box O(FoxO) signaling pathway on PRNP expression of insulin-like growth factor 1 (IGF-1) regulating nerve cells PC12. Methods PC12 cells in logarithmic phase were divided into IGF-1 group, experiment group 1, experiment group 2 and the control group. The cells in the IGF-1 group were added with 80 ng/ml IGF-1, cells in the experiment group 1 and experiment group 2 were separately added with 25 and 50 μmol/L LY294002, followed by 80 ng/ml IGF-1 after 30 min 37℃ cultivation. The control group was not given drugs. After 24 h of cultivation, the PRNP mRNA expression of PC12 cells was calculated by real-time fluorescent quantitative PCR in each group. The AKT phosphorylation, AKT phosphorylation (pAKT), FoxO3a and FoxO3a (pFoxO3a) protein expression of PC12 cells was measured by Western blotting in each group. Results The PRNP mRNA and pAKT, pFoxO3a protein expression of the IGF-1 group was higher than that of the control group (allP<0.05). The PRNP mRNA and pAKT, pFoxO3a protein expression of experiment group 1 and experiment group 2 was lower than that of the IGF-1 group (allP<0.05), and the experimental group 2 was lower than the experimental group 1 (P<0.05). Conclusion IGF 1 could regulate PRNP gene expression of PC12 cells through phosphorylation PI3K/Akt/ FoxO signaling pathway proteins Akt and FoxO3a.

phosphatidyl inositol 3-kinase; protein kinase B; forkhead box O; insulin-like growth factor 1; PRNP gene

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(黔科合LH字-2015-7466號(hào))。

蔣國(guó)紅(1979-)，男，漢，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)退行性疾病及腦血管病基礎(chǔ)與臨床。E-mail： 421855696@qq.com

王長(zhǎng)明(1975-)，男，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)退化性疾病及腦血管病基礎(chǔ)與臨床。E-mail： 421855696@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.006

R741.05

A

1002-266X(2017)11-0019-03

2016-10-22)