劉建軍，韓慶斌，李新志，黃亮，王茂鵬

（1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院骨科；2.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 宜昌 443001）

神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)大鼠脛骨骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究

劉建軍1，韓慶斌1，李新志1，黃亮2，王茂鵬1

（1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院骨科；2.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 宜昌 443001）

目的 觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠脛骨骨折愈合以及胰島素樣生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響。方法建立標(biāo)準(zhǔn)大鼠脛骨骨折模型,分別給予生理鹽水和神經(jīng)生長(zhǎng)因子，術(shù)后1、2、4周分別進(jìn)行X線(xiàn)骨痂評(píng)定、脛骨濕重稱(chēng)量以及半定量RT-PCR檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果術(shù)后4周時(shí)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子組骨痂量（132.63±5.98）mm3和脛骨濕重（0.98±0.12）g，對(duì)照組骨痂量（85.22±6.23）mm3和脛骨濕重（0.84±0.04）g，NGF組顯著多于對(duì)照組(P＜0.05)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子組的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 mRNA的表達(dá)術(shù)后1周時(shí)為（0.82±0.17），術(shù)后2周時(shí)為（0.54±0.08），對(duì)照組分別為（0.55±0.20）、（0.41±0.09）。NGF組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)大鼠脛骨各組愈合，同時(shí)促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中IGF-1表達(dá)。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子；骨折愈合；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；大鼠；脛骨骨折模型

神經(jīng)因素在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，眾多神經(jīng)因子，特別是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，對(duì)骨折愈合的促進(jìn)作用日益得到證實(shí)[1-2]。然而，神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制尚不完全清楚，有研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子與其它細(xì)胞因子之間存在協(xié)同作用，但神經(jīng)生長(zhǎng)因子與胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)之間的聯(lián)系尚不明確。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1是對(duì)成骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和分化作用的一種生長(zhǎng)因子，既可以作用在局部又可作用在全身[3]。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立中樞神經(jīng)損傷合并大鼠脛骨骨折的模型，研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療骨折時(shí)，對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的表達(dá)的影響，以期望進(jìn)一步探討神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 健康雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(260±20)g，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。注射用神經(jīng)生長(zhǎng)因子由廈門(mén)北大之路生物工程有限公司提供；總RNA分離試劑、RT-PCR試劑盒分別購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、大連寶生物工程有限公司。引物由上海生物工程公司合成，IGF-1上游為5＇-CTT TGC GGG GCT GAG CT-3＇下游引物為5＇-CTT CAG CGG AGC ACA GT-3＇，

擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為184bp；內(nèi)參照3＇-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）上游引物5＇-CAC CCT GTT GCT GTA GCC ATA TTC＇，下游引物5＇-GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG-3′，擴(kuò)增片斷196bp。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脛骨骨折模型制作 大鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為5%的水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后，對(duì)右后肢脫毛、消毒，于小腿中上1/3行前正中切口長(zhǎng)約1.5 cm,切開(kāi)皮膚皮下及筋膜,扒開(kāi)脛前肌,在脛骨結(jié)節(jié)下1.0 cm處橫形切斷脛骨，以1.0 mm克氏針經(jīng)遠(yuǎn)端髓腔穿出，復(fù)位后逆行打入骨折近端。生理鹽水沖洗，逐層關(guān)閉切口。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，每組給藥如下：第1組為給予等劑量的生理鹽水的正常對(duì)照組；第2組為給予神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組，神經(jīng)生長(zhǎng)因子肌注200 ng/kg，1次/d。分別注射兩側(cè)腓腸肌，給藥1 w、2 w、4 w后,每次隨機(jī)從各組中選取10只大鼠進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3 骨痂評(píng)定 術(shù)后1 w、2 w、4 w麻醉狀態(tài)下行脛骨X線(xiàn)攝片檢查，測(cè)量采用DR閱片的PACS系統(tǒng)，攝片和測(cè)量由兩位醫(yī)生按照雙盲原則進(jìn)行測(cè)定。骨痂體積測(cè)量采用Perkins法，即V=2πr1(r2-r1)L，其中，r1為骨半徑，r2為骨痂半徑，L為骨痂長(zhǎng)度。

1.2.4 脛骨全長(zhǎng)標(biāo)本濕重 術(shù)后1 w、2 w、4 w各組取大鼠，麻醉狀態(tài)下處死動(dòng)物，取脛骨全長(zhǎng)，采集時(shí)均注意保護(hù)骨折附近區(qū)域組織以免破壞骨痂組織，去除內(nèi)固定物，用天平稱(chēng)脛骨全長(zhǎng)標(biāo)本濕重。

1.2.5 應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)mRNA的表達(dá) 于骨折處上、下各2 mm處截取骨痂標(biāo)本，液氮凍存。標(biāo)本研磨勻漿后，以Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，分別以各自的引物擴(kuò)增GAPDH、IGF-1。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 45s、54℃ 45s、72℃ 45s；72℃延伸6 min，進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參照，DNA條帶的單位面積光密度(OD)用凝膠成像儀測(cè)定,以待測(cè)基因與相應(yīng)內(nèi)參照光密度比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量。圖像分析采用真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Image-proplus 6.0)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用大鼠60只，無(wú)脫失，全部進(jìn)入結(jié)果分析。

2.1 X線(xiàn)骨痂體積測(cè)量 術(shù)后1 w時(shí)兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后2 w時(shí)，NGF組骨痂量多于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后4 w時(shí)，NGF組骨痂量顯著多于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 術(shù)后兩組大鼠骨痂體積測(cè)量結(jié)果(mm3)Table 1 Comparison of bony callus volume between two groups(mm3)

2.2 脛骨濕重稱(chēng)量 術(shù)后1 w和2 w兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后4 w時(shí)，NGF組骨脛骨濕重顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)mRNA表達(dá)的測(cè)定 術(shù)后1 w和2 w時(shí)，NGF組IGF-1 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，尤其以術(shù)后第1周時(shí)更明顯(P＜0.01)；術(shù)后4 w時(shí)，兩組表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3、圖1。

表2 術(shù)后兩組大鼠脛骨濕重測(cè)量結(jié)果(g)Table 2 Comparison of tibia wet weighing between two groups(g)

表3 術(shù)后兩組大鼠IGF-1 mRNA表達(dá)(IGF-1/GAPDH)Table 3 Comparison of the expression of IGF-1 mRNAbetween two groups(IGF-1/GAPDH)

圖1 術(shù)后胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)mRNA PCR電泳圖Figure 1 The electrophoregram of IGF-1 mRNA注：M為Marker，1、3、5分別為術(shù)后1w、2w、4w時(shí)IGF-1 mRNA；2、4、6分別為術(shù)后1w、2w、4w時(shí)GAPDH mRNA

3 討論

隨著高能量和開(kāi)放性損傷病例的增多，以及不當(dāng)?shù)氖中g(shù)治療，骨折不愈合的病例在臨床上屢見(jiàn)不鮮。盡管眾多新觀念、新技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐，但骨折不愈合的治療目前仍然面臨著許多難題。骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的骨再生過(guò)程，除適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)環(huán)境等因素外，多種組織細(xì)胞及各種細(xì)胞因子之間的相互作用在骨折的愈合中也發(fā)揮了重要的作用。

學(xué)界很早就注意到合并中樞神經(jīng)損傷的骨折愈合明顯加速，骨痂生成明顯增多[4]。Bidner的研究認(rèn)為中樞神經(jīng)損傷后，某些生長(zhǎng)因子能夠透過(guò)血腦屏障釋放出來(lái)，作用于骨折局部發(fā)揮作用[5]。因而，以神經(jīng)生長(zhǎng)因子為代表的神經(jīng)因子在骨折愈合中的作用得到了廣泛關(guān)注。神經(jīng)生長(zhǎng)因子是最初發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生長(zhǎng)發(fā)育的因子，并作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。隨著研究的深入，神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的作用也日益證實(shí)[6-7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在骨折斷端局部注射治療NGF后，骨痂生成量明顯增多，骨痂剛度和抗折彎強(qiáng)度也顯著增加[8]。國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究也證實(shí)神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)骨折的修復(fù)起著促進(jìn)作用[9]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入，神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)交感和感覺(jué)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入骨痂的同時(shí),還能刺激P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽等神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)的釋放，而這些肽類(lèi)物質(zhì)能通過(guò)抑制骨吸收，促進(jìn)骨折的成骨[10]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化,加速毛細(xì)血管的形成,改善骨折處的血液供應(yīng)。而其中，刺激骨細(xì)胞增殖分化，刺激成骨細(xì)胞活性，是神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的一條重要途徑[9]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1是骨細(xì)胞中含量豐富的生長(zhǎng)因子，對(duì)成骨細(xì)胞功能起到重要的調(diào)節(jié)作用。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1在合并腦外傷的骨折患者血清中的水平明顯升高。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1可促使成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，減少骨膠原退化，增加骨質(zhì)沉積，此外還能促進(jìn)骨基質(zhì)合成鈣化，加速骨折愈合。

本實(shí)驗(yàn)也觀察到，神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的同時(shí)，也明顯促進(jìn)了胰島素樣生長(zhǎng)因子的分泌。胰島素樣生長(zhǎng)因子是骨細(xì)胞增值分化的重要刺激因子，因而，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可能通過(guò)刺激胰島素樣生長(zhǎng)因子的分泌，來(lái)刺激骨細(xì)胞的增殖分化，這可能是神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的重要途徑之一。學(xué)界越來(lái)越認(rèn)識(shí)到，活性細(xì)胞因子在骨折愈合中發(fā)揮的重要作用，深入探究骨折愈合中各種生長(zhǎng)因子的作用及機(jī)理，進(jìn)一步闡明骨折不愈合和延遲愈合的產(chǎn)生機(jī)制，必將為骨折的治療，特別是骨折不愈合的治療起到積極作用。

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Nerve growth factor promotes the bone healing on tibial fracture model of rats

Liu Jian-jun1,Han Qin-bin1,Li Xin-zhi1,Huang Liang2,Wang Mao-peng1
(1.Department of Orthopaedic,Renhe Hospital,Three Gorges University;2.Department of Nephrology,Renhe Hospital,Three Gorges University,Yichang,Hubei,443001,China)

ObjectiveTo study the effect of nerve growth factor(NGF)on tibial fracture healing in rats，and the expression of insulin-like grouth factor-1(IGF-1).Methods60 SD rats were randomly divided into the control group and NGF group.All rats were established tibial fracture models,and were treated by normal saline(NS)or NGF respectively.Then the bony callus volume were evaluated by X-ray at 1,2 and 4 weeks after operation,and tibia wet weighing were weighed.The expression of IGF-1 mRNA were assayed with semiquantitative RT-PCR too.ResultsIn NGF group，bony callus volume is(132.63±5.98)mm3and tibia wet weighing is(0.98±0.12)g.In control group,bony callus volume is(85.22±6.23)mm3and tibia wet weighing is(0.84±0.04)g.NGF group were increased significantly at 4 weeks after operation,compared with the control group(P＜0.05).The expression of IGF-1 mRNA in NGF group,which is(0.82±0.17)at 1 week,(0.54±0.08)at 2 weeks,were increased significantly at 1,2 weeks after operation(P＜0.05),compared with the control group,which is(0.55±0.20)at 1 week,(0.41±0.09)at 2 weeks.Conclusion The results suggest that NGF can stimulated bone healing,and promoted the expression of IGF-1 in the fracture healing process.

Nerve growth factor;Fracture healing;Insulin-like grouth factor-1;Rat;Tibial fracture model

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.11.001

三峽大學(xué)2012年青年基金（KJ2012A020）