昆山吉和力儀器有限公司(以下簡稱“吉和力”)是一家提供專業(yè)服務(wù)和儀器設(shè)備的集成供應(yīng)商,公司以用戶實(shí)際需求為導(dǎo)向,提供最合適、性價(jià)比最高的儀器,致力于打造一站式服務(wù)平臺(tái)。為了讓業(yè)內(nèi)人士對qPCR進(jìn)行更加深入的了解,吉和力整理了一些相關(guān)常見問題,并對這些問題一一進(jìn)行了解答。
qPCR的英文全稱是Real-time Quantitative PCR Detecting System,即實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng),也叫實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng),簡稱qPCR。
簡單來說,qPCR就是利用熒光信號(hào)的變化,實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。而常規(guī)的PCR無法對起始模板準(zhǔn)確定量,無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測。
如何提高RT-PCR反應(yīng)的靈敏度與特異性?
①確定模板RNA完整性,無DNA污染;
②RNA模板中不應(yīng)含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑;
③為了防止模板降解,在反應(yīng)體系中加入RNase抑制劑RNasin;
④使用適量的模板RNA,模板量太多會(huì)降低特異性,太少會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱;
⑤若模板中有二級結(jié)構(gòu),可通過提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來提高擴(kuò)增效果;
⑥設(shè)計(jì)引物時(shí),避免在引物3端含有互補(bǔ)序列,避免形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
避免RNA降解的方法有哪些?
①在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA;
②運(yùn)用良好無污染技術(shù)分離RNA;
③將組織從動(dòng)物體取出后立刻提取RNA,并將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行低溫保存。
RNA中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時(shí),怎么處理?
逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括:SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽,可將對照RNA與樣品混合,同對照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢測RNA抑制劑;若對照RNA與樣品混合后產(chǎn)量降低,則說明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑,可用70%(v/v)乙醇對RNA沉淀進(jìn)行清洗,以除去抑制劑。
如何減少RNA模板中的二級結(jié)構(gòu)?
①將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性、退火,提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度;
②溫度超過60℃時(shí),不能使用oligo(dT)引物,選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP;
③RT-PCR產(chǎn)物的長度超過1kb時(shí),反應(yīng)溫度需保持在65℃。
RNA中有DNA污染的處理方式
①若是基因組DNA的污染,可使用DNaseI處理RNA,同時(shí)設(shè)置沒有逆轉(zhuǎn)錄對照組反應(yīng)檢測DNA污染;
②若是受到外源DNA的污染,可使用抗氣霧劑和UDG酶。
qPCR探針設(shè)計(jì)的一般原則有哪些?
①擴(kuò)增片段的長度不應(yīng)太大,一般小于300bp;
②探針不能和任一引物互補(bǔ),且其長度在保證特異性的前提下盡可能的短,長度不要超過30bp;
②探針的Tm值至少比引物的Tm值高5度;
③探針如用于檢測多態(tài)位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)應(yīng)盡可能靠近探針中部;
④探針5端不能是堿基G,G對熒光基團(tuán)有猝滅作用。
無反轉(zhuǎn)錄酶情況下,對照RNA仍有擴(kuò)增結(jié)果
①體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有DNA模板消除,因而對照組會(huì)含有痕量的DNA。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影響;
②可能是引物二聚體的條帶。
擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中
①可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物,建議將第一鏈cDNA濃度稀釋至100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增;
②在二次PCR時(shí),使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃,可將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。
無Ct信號(hào)出現(xiàn)
①反應(yīng)循環(huán)參數(shù)不夠,一般要在35個(gè)循環(huán)以上,但是過多的循環(huán)次數(shù)可增加背景值;
②檢測熒光信號(hào)的步驟有誤。SYBRgreen法(SG法)采用的是72℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào),taqman法則是在退火結(jié)束或延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行信號(hào)采集;
③引物或探針降解,可用PAGE電泳檢測其完整性,若是電泳條帶呈彌散狀,可考慮重新合成引物或探針;
④模板不足或降解,則可以重新提取核酸模板。
Ct值出現(xiàn)過晚(Ct>38)
①擴(kuò)增效率低,反應(yīng)條件不夠優(yōu)化,降低退火溫度,增加鎂離子濃度;
②反應(yīng)成分降解或加樣量不足;
③PCR產(chǎn)物過長,一般采用80-150bp。
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳
①加樣存在誤差,是樣品濃度不成梯度;
②標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解,避免反復(fù)凍融;
③引物或者探針設(shè)計(jì)不佳;
④模板中存在抑制物或模板濃度過高。
溶解曲線存在多個(gè)主峰
①引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化;
②引物濃度不佳,上下游引物濃度比例不一致;
③鎂離子濃度過高;
④模板基因組的污染。
同一樣品中,其中某一個(gè)熒光信號(hào)特別強(qiáng)
①試劑配制時(shí)反應(yīng)液沒有完全溶化,導(dǎo)致探針量在一管增多;
②試劑配制時(shí)沒有充分混勻致各管中各成分的量不同;
③PCR儀熱槽被熒光物質(zhì)污染,需要清除熱槽中的污染。
擴(kuò)增曲線有一向上或向下的尖峰?
①反應(yīng)過程中電壓不穩(wěn)定;
②可能在20個(gè)循環(huán)左右時(shí),儀器有停下或儀器有開蓋,使光線突然增強(qiáng);
③如果尖峰向下,可能是由鹵素?zé)衾匣拢@時(shí)應(yīng)更換。
部分樣本擴(kuò)增效率過低?
①提取液殘留,一定程度抑制了PCR反應(yīng);
②反應(yīng)液未嚴(yán)格取量混勻或分裝不均勻;
③試劑失效。
陰性對照或空白對照翹尾
①模板提取環(huán)境或操作過程有污染;
②配液過程存在污染。
直線型擴(kuò)增曲線
①探針部分降解:一般稀釋的探針可在4℃保存至少3個(gè)月,探針的反復(fù)凍融或?qū)е陆到?;或者探針在光線下暴露時(shí)間太長了;
②反應(yīng)液中有PCR抑制物。
沒有擴(kuò)增曲線
①PCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤,在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)將熒光信號(hào)讀取時(shí)間設(shè)在反應(yīng)的第一步,即stage1階段;
②電腦設(shè)定了自動(dòng)休眠。
基線下滑
基線選取范圍不對,可試著將基線范圍改大一些,這一問題常因試劑質(zhì)量所致。
擴(kuò)增曲線斷裂
基線選取范圍不對,基線終點(diǎn)大于Ct值,這通常是由于模板DNA濃度過高所致,因Ct值<15,而基線范圍仍取3~15,其中包含部分?jǐn)U增信號(hào),導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大,閾值過高,解決辦法:減少基線終點(diǎn)至Ct前4個(gè)循環(huán),重新分析數(shù)據(jù)。
樣品濃度跨度過大
樣品濃度過高,導(dǎo)致陽性樣品擴(kuò)增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線,其解決方法同“擴(kuò)增曲線斷裂”。
山坡形曲線
常因反應(yīng)管封口不嚴(yán),至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。