昆山吉和力儀器有限公司（以下簡稱“吉和力”）是一家提供專業(yè)服務(wù)和儀器設(shè)備的集成供應(yīng)商，公司以用戶實(shí)際需求為導(dǎo)向，提供最合適、性價(jià)比最高的儀器，致力于打造一站式服務(wù)平臺(tái)。為了讓業(yè)內(nèi)人士對qPCR進(jìn)行更加深入的了解，吉和力整理了一些相關(guān)常見問題，并對這些問題一一進(jìn)行了解答。

qPCR的英文全稱是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)，也叫實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)，簡稱qPCR。

簡單來說，qPCR就是利用熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。而常規(guī)的PCR無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測。

如何提高RT-PCR反應(yīng)的靈敏度與特異性？

①確定模板RNA完整性，無DNA污染；

②RNA模板中不應(yīng)含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑；

③為了防止模板降解，在反應(yīng)體系中加入RNase抑制劑RNasin；

④使用適量的模板RNA，模板量太多會(huì)降低特異性，太少會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱；

⑤若模板中有二級結(jié)構(gòu)，可通過提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來提高擴(kuò)增效果；

⑥設(shè)計(jì)引物時(shí)，避免在引物3端含有互補(bǔ)序列，避免形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

避免RNA降解的方法有哪些？

①在用來驗(yàn)證完整性之前先在變性膠上分析RNA；

②運(yùn)用良好無污染技術(shù)分離RNA；

③將組織從動(dòng)物體取出后立刻提取RNA，并將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行低溫保存。

RNA中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時(shí)，怎么處理？

逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽，可將對照RNA與樣品混合，同對照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢測RNA抑制劑；若對照RNA與樣品混合后產(chǎn)量降低，則說明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對RNA沉淀進(jìn)行清洗，以除去抑制劑。

如何減少RNA模板中的二級結(jié)構(gòu)？

①將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性、退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度；

②溫度超過60℃時(shí)，不能使用oligo（dT）引物，選擇一個(gè)在反應(yīng)溫度可以退火的GSP；

③RT-PCR產(chǎn)物的長度超過1kb時(shí)，反應(yīng)溫度需保持在65℃。

RNA中有DNA污染的處理方式

①若是基因組DNA的污染，可使用DNaseI處理RNA，同時(shí)設(shè)置沒有逆轉(zhuǎn)錄對照組反應(yīng)檢測DNA污染；

②若是受到外源DNA的污染，可使用抗氣霧劑和UDG酶。

qPCR探針設(shè)計(jì)的一般原則有哪些？

①擴(kuò)增片段的長度不應(yīng)太大，一般小于300bp；

②探針不能和任一引物互補(bǔ)，且其長度在保證特異性的前提下盡可能的短，長度不要超過30bp；

②探針的Tm值至少比引物的Tm值高5度；

③探針如用于檢測多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)應(yīng)盡可能靠近探針中部；

④探針5端不能是堿基G，G對熒光基團(tuán)有猝滅作用。

無反轉(zhuǎn)錄酶情況下，對照RNA仍有擴(kuò)增結(jié)果

①體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有DNA模板消除，因而對照組會(huì)含有痕量的DNA。建議可將第一鏈cDNA稀釋1：10、1：100、1：1000倍以消除DNA污染造成的影響；

②可能是引物二聚體的條帶。

擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

①可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物，建議將第一鏈cDNA濃度稀釋至100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增；

②在二次PCR時(shí)，使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

無Ct信號(hào)出現(xiàn)

①反應(yīng)循環(huán)參數(shù)不夠，一般要在35個(gè)循環(huán)以上，但是過多的循環(huán)次數(shù)可增加背景值；

②檢測熒光信號(hào)的步驟有誤。SYBRgreen法（SG法）采用的是72℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，taqman法則是在退火結(jié)束或延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行信號(hào)采集；

③引物或探針降解，可用PAGE電泳檢測其完整性，若是電泳條帶呈彌散狀，可考慮重新合成引物或探針；

④模板不足或降解，則可以重新提取核酸模板。

Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

①擴(kuò)增效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，降低退火溫度，增加鎂離子濃度；

②反應(yīng)成分降解或加樣量不足；

③PCR產(chǎn)物過長，一般采用80-150bp。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

①加樣存在誤差，是樣品濃度不成梯度；

②標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解，避免反復(fù)凍融；

③引物或者探針設(shè)計(jì)不佳；

④模板中存在抑制物或模板濃度過高。

溶解曲線存在多個(gè)主峰

①引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化；

②引物濃度不佳，上下游引物濃度比例不一致；

③鎂離子濃度過高；

④模板基因組的污染。

同一樣品中，其中某一個(gè)熒光信號(hào)特別強(qiáng)

①試劑配制時(shí)反應(yīng)液沒有完全溶化，導(dǎo)致探針量在一管增多；

②試劑配制時(shí)沒有充分混勻致各管中各成分的量不同；

③PCR儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，需要清除熱槽中的污染。

擴(kuò)增曲線有一向上或向下的尖峰？

①反應(yīng)過程中電壓不穩(wěn)定；

②可能在20個(gè)循環(huán)左右時(shí)，儀器有停下或儀器有開蓋，使光線突然增強(qiáng)；

③如果尖峰向下，可能是由鹵素?zé)衾匣拢@時(shí)應(yīng)更換。

部分樣本擴(kuò)增效率過低？

①提取液殘留，一定程度抑制了PCR反應(yīng)；

②反應(yīng)液未嚴(yán)格取量混勻或分裝不均勻；

③試劑失效。

陰性對照或空白對照翹尾

①模板提取環(huán)境或操作過程有污染；

②配液過程存在污染。

直線型擴(kuò)增曲線

①探針部分降解：一般稀釋的探針可在4℃保存至少3個(gè)月，探針的反復(fù)凍融或?qū)е陆到?；或者探針在光線下暴露時(shí)間太長了；

②反應(yīng)液中有PCR抑制物。

沒有擴(kuò)增曲線

①PCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)將熒光信號(hào)讀取時(shí)間設(shè)在反應(yīng)的第一步，即stage1階段；

②電腦設(shè)定了自動(dòng)休眠。

基線下滑

基線選取范圍不對，可試著將基線范圍改大一些，這一問題常因試劑質(zhì)量所致。

擴(kuò)增曲線斷裂

基線選取范圍不對，基線終點(diǎn)大于Ct值，這通常是由于模板DNA濃度過高所致，因Ct值<15，而基線范圍仍取3～15，其中包含部分?jǐn)U增信號(hào)，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過高，解決辦法：減少基線終點(diǎn)至Ct前4個(gè)循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。

樣品濃度跨度過大

樣品濃度過高，導(dǎo)致陽性樣品擴(kuò)增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，其解決方法同“擴(kuò)增曲線斷裂”。

山坡形曲線

常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。